Ex Vivo Tarm Sacs å vurdere slimhinner Permeabilitet i modeller av gastrointestinal sykdom

Summary

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Abstract

Epiteliale barrieren er den første medfødt forsvar av mage-tarmkanalen og selektivt regulerer transport fra lumenet til de underliggende vev kamrene, som begrenser transporten av mindre molekyler på tvers av epitelet og nesten fullstendig forbud mot epitel makromolekylær transport. Denne selektivitet er bestemt av den slimete gel-lag, som begrenser transporten av lipofile molekyler og både de apikale reseptorer og stramme synaptiske proteinkomplekser av epitelet. In vitro cellekultur modeller av epitelet er praktisk, men som en modell, de mangler kompleksiteten i samspillet mellom bakterieflora, slimete-gel, epitel og immunsystem. På den annen side, kan in vivo-evaluering av intestinal absorpsjon eller permeabilitet skal utføres, men disse analysene måle samlet gastrointestinal absorpsjon, uten noen indikasjon på området spesifisitet. Ex vivo-permeabilitet-analyser ved hjelp av "tarm" sekker; er en hurtig og følsom metode for å måle enten samlet intestinal integritet eller sammen transport av et spesifikt molekyl, med den ekstra fordelen av intestinale området spesifisitet. Her beskriver vi utarbeidelsen av tarm sekker for permeabilitet studier og beregningen av den tilsynelatende permeabilitet (P _app) av et molekyl på tvers av tarmbarrieren. Denne teknikken kan bli anvendt som en metode for å vurdere medikament absorpsjonen, eller for å undersøke regional epitele barrieren dysfunksjon i dyremodeller av gastrointestinal sykdom.

Introduction

Intestinal epithelial barrieren i fordøyelseskanalen er en slimhinneoverflateareal beregnet på 400 m ² i et voksent menneske. Følgelig er det stadig utsatt flagget fra mikrober, inntatte legemidler, næringsstoffer og bakterielle toksiner. Verten må ikke bare skille mellom tolererkommensale bakterier og potensielle patogener, men må forhindre at disse arter og deres utskilte molekyler fra krysset epiteliale barriere, mens på samme tid slik at absorpsjon av næringsstoffer. Således er rollen til tarmepitelet for å virke som en selektiv barriere for de luminale innhold ^1. Dette oppnås delvis ved det medfødte epithelial forsvarssystemet på mukosa, som virker gjennom en responsiv biologisk system som består av konstitutive og induserbare mekanismer ^2.

Tap av epitelial barrierefunksjonen er en patologi som er karakteristisk for en rekke av gastrointestinale sykdommer. In vivo-undersøkelse av epitelial barrierefunksjonen kan bli vurdert gjennom oralt inntak av en tracer molekyl og påfølgende serum analyse ^3. Men denne teknikken gir ingen indikasjon med hensyn til området for barrieren dysfunksjon. In vitro og ex vivo vurdering av transepitelial motstand ved hjelp av Transwell systemer ³ og Ussing-kammere ^4,5 henholdsvis, blir ofte anvendt som surrogatmarkører for epitelial barrierefunksjon, men mangler den medvirkende sykdom fysiologi av dyremodeller ^6. I denne protokollen beskriver vi en ex vivo vev fremstilling modell som gjør det mulig direkte og lokalisert evaluering av intestinal integritet, og som kan brukes til å vurdere mucosal barrierefunksjon på en rekke nivåer. Viktigere, kan denne teknikken bli anvendt for å dyremodeller av sykdom, eller kan være farmakologisk manipulert til å tillate grundig utspørring av slimhinnebarriere dysfunksjon.

Protocol

Alle dyr arbeid i denne protokollen er utført med streng overholdelse av University of Newcastle dyreetikk Komiteen godkjente prosedyrer. 1. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Media and Dishes Forvarm Media 199 (TC199) eller Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) media til 37 ° C. Pre-oksygenatom mediet ved å boble med 95% O2 / 5% CO2. Sjekk at mediet har en endelig pH på 7,3. Forbered sutur ved å kutte to 5 cm seksjoner for hve…

Representative Results

Denne protokollen kan bli brukt til å undersøke regionale forandringer i tarmbarriere i dyremodeller av gastrointestinal sykdom. Ved å måle fluksen av en paracellulære sonde over mukosal overflate ved forskjellige områder av mage-tarmkanalen 7, kan integriteten av epiteliale tett veikryss bli vurdert. I tillegg, ved å variere arten av den paracellulære sonde med størrelse (figur 2) eller hydrofobi (figur 3), graden av epiteliale forst…

Discussion

Her har vi inngående isolasjon og forberedelse av tarm sekker for å vurdere slimhinnene barrierefunksjon ex vivo. Tarm sac forberedelsene har først og fremst vært brukt i farmasøytisk forskning, undersøke opptaket av kandidat narkotika over tarmen. Imidlertid er denne analysen like godt egnet for undersøkelse av tarmsykdom. Intestinal permeabilitet kan variere sterkt fra region til region og språk konkret vurdering av permeabilitet gir en bedre forståelse av den regionale betydningen av mucosal integri…

Materials

Dekantel  Non-absorbable Silk suture	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich		Use at 10mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW	Sigma Aldrich	FD-70