Экс Vivo Кишечные Sacs для оценки слизистой проницаемости в моделях желудочно-кишечные заболевания
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
Эпителиальный барьер является первым врожденным защита желудочно-кишечного тракта и избирательно регулирует транспорт из просвета к нижележащим тканях, ограничивая перенос мелких молекул через эпителий и практически полностью запрещающий эпителиальную макромолекулярную транспорт. Эта селективность определяется слизистой слоя геля, который ограничивает транспорт липофильных молекул и обоих апикальных рецепторов и узких соединительных белковых комплексов эпителия. В пробирке модели культуры клеток эпителия удобны, но в качестве модели, им не хватает сложность взаимодействий между микробиоты, слизистой-гель, эпителий и иммунной системы. С другой стороны, в естественных условиях оценка поглощения или проницаемости кишечника может быть выполнена, но эти анализы измерить общую желудочно-кишечную абсорбцию, без указания площадке специфичности. Экс естественных проницаемости анализов с использованием "кишечные мешочки"; являются быстрый и чувствительный метод измерения либо общую целостности кишечного или сравнительный перевозки конкретных молекулы, с дополнительным преимуществом кишечной специфики сайта. Здесь мы опишем приготовление кишечных мешков для исследований проницаемости и вычисление очевидно проницаемости (P приложение) молекулы через кишечный барьер. Эта техника может быть использована в качестве метода оценки абсорбции лекарственного, или изучить региональную эпителиальный барьер дисфункции у животных моделях желудочно-кишечных заболеваний.
Introduction
Кишечного эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта является площадь поверхности слизистой оценивается в 400 м 2 в взрослого человека. Следовательно, она постоянно подвергается вызов от микробов, попадает препаратов, питательных веществ и бактериальных токсинов. Хост должен не только различать приемлемые синантропных бактерий и потенциально патогенных микроорганизмов, но должна предотвратить эти виды и их секретируемые молекулы от пересечения эпителиальный барьер, в то же время позволяя поглощение питательных веществ. Таким образом, роль кишечном эпителии будет действовать в качестве селективного барьера к просветными Содержание 1. Это достигается, в частности, путем врожденной эпителиальной защитной системы на слизистой, который действует через реагировать биологической системе, состоящей из конститутивных и индуцируемых механизмов 2.
Потеря функции эпителиальный барьер является патологией, что является характерной чертой ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта. В естественных условияхэкспертиза эпителиальной барьерной функции могут быть оценены через желудочный зонд молекулы индикаторного и последующего анализа сыворотки 3. Однако эта методика не дает никаких указаний на сайт барьерного дисфункции. В пробирке и экс естественных оценки сопротивления трансэпителиального использованием Transwell системы 3 и Ussing камеры 4,5 соответственно, которые обычно используют в качестве суррогатных маркеров эпителиальных барьерной функции, но не хватает способствуя физиологию болезни животных моделей 6. В этом протоколе мы опишем модель подготовки экс виво ткани, обеспечивающую прямое и локализованное оценку кишечной целостности и который может быть использован для оценки слизистой барьерной функции при нескольких уровнях. Важно отметить, что эта методика может быть применена к животных моделях болезни, или может быть фармакологически манипулировать, чтобы позволить в глубине допроса слизистой барьерной дисфункции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно выделение и подготовку кишечника мешочков для оценки слизистой барьерную функцию Экс Vivo. Кишечные препараты SAC уже в основном были использованы в фармацевтических исследованиях, изучая поглощение кандидатов наркотиков через кишечник. Тем не менее, этот анализ в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
