Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
La barrera epitelial es la primera defensa innata del tracto gastrointestinal y regula selectivamente el transporte desde el lumen a los compartimentos de tejido subyacente, lo que restringe el transporte de moléculas más pequeñas a través del epitelio y casi prohíbe completamente el transporte macromolecular epitelial. Esta selectividad se determina por la capa de gel mucoso, lo que limita el transporte de moléculas lipófilas y tanto los receptores apicales y apretado complejos de proteínas de unión del epitelio. Modelos in vitro de cultivo de células del epitelio son convenientes, pero como modelo, que carecen de la complejidad de las interacciones entre la microbiota, mucosa-gel, el epitelio y el sistema inmunológico. Por otra parte, la evaluación in vivo de la absorción intestinal o la permeabilidad se puede realizar, pero estos ensayos miden la absorción gastrointestinal en general, sin ninguna indicación de especificidad de sitio. Ex vivo usando ensayos de paso de "sacos intestinales"; son un método rápido y sensible de la medición de ya sea la integridad intestinal en general o el transporte comparativo de una molécula específica, con la ventaja adicional de especificidad de sitio intestinal. Aquí se describe la preparación de sacos intestinales para estudios de permeabilidad y el cálculo de la aparente permeabilidad (app P) de una molécula a través de la barrera intestinal. Esta técnica se puede utilizar como un método de evaluación de la absorción del fármaco, o para el examen disfunción de la barrera epitelial regional en modelos animales de la enfermedad gastrointestinal.
Introduction
La barrera epitelial intestinal del tracto gastrointestinal es un área de superficie de la mucosa se estima en 400 m 2 en el adulto humano. En consecuencia, se expone constantemente a desafiar a partir de microbios, fármacos ingeridos, nutrientes y toxinas bacterianas. El anfitrión no sólo debe distinguir entre las bacterias comensales tolerables y patógenos potenciales, pero debe evitar que estas especies y sus moléculas secretadas de atravesar la barrera epitelial, mientras que al mismo tiempo que permite la absorción de nutrientes. Por lo tanto, el papel del epitelio intestinal es actuar como una barrera selectiva a los contenidos luminales 1. Esto se consigue, en parte, por el sistema de defensa innata epitelial en la mucosa, que actúa a través de un sistema biológico sensible que consiste en mecanismos constitutivos e inducibles 2.
La pérdida de la función de la barrera epitelial es una patología que es característica de un número de enfermedades gastrointestinales. In vivoexamen de la función de barrera epitelial puede ser evaluada a través de una sonda nasogástrica de una molécula del marcador, y su posterior análisis del suero 3. Sin embargo, esta técnica no ofrece ninguna indicación en cuanto al sitio de la disfunción de la barrera. In vitro y ex vivo evaluación de la resistencia transepitelial utilizando sistemas Transwell 3 y cámaras Ussing 4,5 respectivamente, se emplean comúnmente como marcadores indirectos de la función de la barrera epitelial, pero carecen de la fisiología de la enfermedad contribuyendo de modelos animales 6. En este protocolo se describe un modelo de preparación de tejido ex vivo que permite la evaluación directa y localizada de la integridad intestinal y que puede utilizarse para evaluar la función barrera de la mucosa en un número de niveles. Es importante destacar que esta técnica puede aplicarse a modelos animales de enfermedad, o puede ser manipulado para permitir farmacológicamente en interrogatorio profundidad de disfunción de la barrera de la mucosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos detallado el aislamiento y la preparación de los sacos intestinales para evaluar la función barrera de la mucosa ex vivo. preparaciones saco intestinal principalmente se han utilizado en la investigación farmacéutica, el examen de la absorción de los fármacos candidatos a través del intestino. Sin embargo, este ensayo es igualmente bien adecuada para el estudio de la enfermedad intestinal. la permeabilidad intestinal puede variar considerablemente según la región y la evaluación específi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
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