Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da<em> Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

La particolare batterio sotto inchiesta qui (S. pasteurii) è unico nella sua capacità, nelle giuste condizioni, di indurre l'idrolisi di urea (ureolysis) in ambienti presenti in natura attraverso la secrezione di un ureasi. Questo processo di ureolysis, attraverso una catena di reazioni chimiche, porta alla formazione di precipitati di carbonato di calcio. Questo è noto come Microbiologicamente Induced Calcite Precipitazioni (MICP). I protocolli di coltura adeguate per MICP sono descritti qui. Infine, esperimenti di visualizzazione in diverse modalità di microscopia sono state effettuate per capire i vari aspetti del processo di precipitazione. Tecniche come la microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettroni Spectroscopy (XPS) sono stati impiegati per caratterizzare chimicamente il prodotto finale. Inoltre, la capacità di questi precipitati ad ostruire i pori all'interno di un mezzo poroso naturale è stato dimostrato attraverso un esperimento qualitativa dove spugnabarre sono stati usati per simulare un poro-rete con una gamma di scale di lunghezza. Una barra spugna imbevuta nel terreno di coltura contenente le cellule batteriche indurisce l'intasamento dei suoi pori risultanti dal processo continuo di precipitazione chimica. Questa barra spugna indurito presenta una resistenza superiore rispetto a un bar spugna controllo che si comprime e spremuto sotto l'azione di un carico esterno applicato, mentre la barra indurito è in grado di sostenere lo stesso peso con poca deformazione.

Introduction

Sporosarcina pasteurii è un batterio gram-positivo in grado di sopravvivere in ambienti fortemente alcaline (pH ~ 10) ¹ ed è una delle specie batteriche che possono diventare un agente causativo di un fenomeno chiamato Microbiologicamente Induced Calcite Precipitation (MICP) ^2-4. MICP è un processo in cui la precipitazione di carbonato di calcio è indotta da certi microbi in condizioni ambientali idonee. S. pasteurii ha assunto importanza negli ultimi anni a causa della sua identificazione come possibile agente per indurre un significativo volume di MICP in determinate condizioni. Questa possibilità deriva dal fatto che S. pasteurii ha la capacità unica di secernere grandi quantità di ureasi. Questo enzima agisce come un catalizzatore, promuovendo una lisi accelerata di urea (un composto biochimico naturale con fornitura diffusa e abbondante) in presenza di molecole di acqua. Attraverso una cascata di reazioni, questo processo finalely porta alla generazione di ioni carbonato carica negativa. Questi ioni, a sua volta, reagire con ioni metallici positivi come calcio per formare infine precipitati di carbonato di calcio (calcite); da qui l'etichetta MICP ^5-9.

Il processo di MICP è stato conosciuto e studiato per diversi decenni ^10,11. Nel corso degli ultimi anni, MICP è stato studiato per un'ampia gamma di applicazioni tecniche e ambientali, compresa bottom-up costruzione verde ^12, il miglioramento delle strutture di grandi dimensioni ^13,14 e il sequestro del carbonio e lo stoccaggio ^15,16.

Ad esempio, Cunnigham ¹⁷ et. Al progettato un reattore a flusso temperatura moderata ad alta pressione contenente un nucleo di arenaria Berea. Il reattore è stato inoculato con il batterio S. fridgidimarina e in condizioni di alta pressione carbonica supercritica iniezione anidride, un massiccio accumulo di biomassa all'interno del poro volUmes stato osservato, che ha portato ad una riduzione superiore al 95% in permeabilità. Jonkers e Schlangen ¹⁸ hanno studiato l'effetto di alcuni ceppi di batteri speciali sul processo di auto-guarigione in calcestruzzo. acqua esterna trasportata nella rete dei pori che entra attraverso i pori della superficie si prevede di attivare i batteri dormienti che a loro volta aiutano resistenza strutturale tramite MICP. Tobler ¹⁹ et al. hanno confrontato l'attività ureolytic di S. pasteurii con una falda indigena ureolytic microcosmo in condizioni che favoriscono MCIP su larga scala e ha scoperto che S. pasteurii ha una capacità costante di migliorare la calcite precipitazioni anche quando le comunità indigene mancava attività ureasica prima. Mortensen ²⁰ et.al hanno studiato gli effetti di fattori esterni come il tipo di suolo, la concentrazione di cloruro di ammonio, salinità, concentrazione di ossigeno e lisi delle cellule su MICP. La loro dimostrazione che il processo di trattamento biologico è molto robusto con respect ad un'ampia variazione nella spazio dei parametri sostanzia l'idoneità di questo processo per varie applicazioni di bonifica su larga scala di cui un processo di arricchimento adeguato per rinforzare i batteri è intrapresa. Phillips ²¹ et. al progettato esperimenti per studiare i cambiamenti nella permeabilità e la forza di una colonna di sabbia ed un nucleo di arenaria dopo l'iniezione con S. culture pasteurii. Essi hanno scoperto che, mentre la permeabilità diminuita 2 – 4 volte mentre la resistenza alla frattura è aumentato tre volte.

S. pasteurii e il suo ruolo nella MICP sono argomenti di ricerca attiva e di diverse questioni relative al meccanismo di precipitazione chimica non sono ancora pienamente compresi. Alla luce di questo, è molto importante avere un set di protocolli standardizzati coerenti con precisione la cultura un magazzino opportunamente arricchito di S. pasteurii per raggiungere MICP. Qui, descriviamo un protocollo rigoroso che assicuri ripetibilità e la riproducibilità. Questo manuscript descrive i protocolli dettagliati per la coltura di S. pasteurii ed opportunamente arricchendo il terreno di coltura per indurre la precipitazione. Il processo è indagato attraverso varie tecniche microscopiche, come ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettrone Spectroscopy (XPS). Il focus del manoscritto è sul processo di MICP. Procedure come SEM e SIMS, essendo protocolli standard consolidati, non sono descritte separatamente.

Protocol

NOTA: Eseguire i protocolli sperimentali nell'ordine descritto di seguito. Il protocollo di coltura batterica è discusso nella sezione 1 (vedi anche figura 1). Sezione 2 descrive il protocollo per arricchire il terreno di coltura utilizzando additivi esterni. La sezione 3 descrive i protocolli per la microscopia multi-mode. I pesi di tutti i singoli componenti possono essere misurati con una bilancia analitica. Volume di ogni soluzione può essere misurata utilizzando un cilindro tarato. <p cla…

Representative Results

S. pasteurii essere un alkaliphile 24 possono sopravvivere in condizioni relativamente difficili. Quando il protocollo cultura di cui sopra è seguita, e S. pasteurii è cresciuto all'interno di una camera, i batteri porta alla precipitazione di carbonato di calcio nel tempo (Figura 2A). Figura 2 (b) mostra un contrasto di fase ottica dell'immagine microscopica della popolazione cellulare batterica nel terreno di colt…

Discussion

Passi critici: Questo manoscritto descrive in dettaglio i protocolli per la coltura di un campione vitale di S. pasteurii. Una volta che la coltura è stato preparato, deve essere opportunamente arricchito. Questo è un passo chiave fondamentale per il successo dell'esperimento, perché un fallimento per fornire l'ambiente chimico adeguato porta a uno scale temporali molto lunghi di precipitazioni o di una completa mancanza della stessa. S. pasteurii è molto sensibile a divers…

Materials

Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium