Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.
Flere metoder er blevet brugt til at registrere og evaluere gastrointestinal motilitet herunder: optagelse ændringer i muskelspændinger, intraluminale pres, og membranpotentialet. Alle disse fremgangsmåder afhænger af måling af aktivitet ved en eller flere steder langs tarmen samtidigt som derefter fortolkes for at tilvejebringe en fornemmelse af den samlede tarmmotilitetsmønstrene. For nylig har udviklingen af videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning (STmap) teknikker gjort det muligt at observere og analysere komplekse mønstre i ex vivo hele segmenter af tyktarmen og tarm. Når registreret og digitaliseret, kan videooptagelser konverteres til STmaps, hvor den luminale diameter omdannes til gråtoner eller [kort diameter kaldes (Dmaps)] farve. STmaps kan levere data om motilitet retning (dvs. stationær, peristaltisk, antiperistaltic), hastighed, varighed, hyppighed og styrke af kontraktile motilitet mønstre. Fordele ved denne fremgangsmåde omfatter: analysis af interaktion eller samtidig udvikling af forskellige motilitet mønstre i forskellige regioner i samme segment, visualisering af motilitet mønster ændrer sig over tid, og analyse af, hvordan aktiviteten i én region påvirker aktivitet i en anden region. Videooptagelser kan afspilles med forskellige tidshorisonter og analyseparametre så separate STmaps og motilitet mønstre kan analyseres nærmere. Denne protokol specifikt detaljer virkningerne af intraluminale væske distension og intraluminale stimuli, der påvirker motilitet generation. Anvendelsen af luminale receptoragonister og antagonister giver mekanistisk information om, hvordan specifikke mønstre påbegyndes og hvordan man mønster kan omdannes til et andet mønster. Teknikken er begrænset af evnen til kun måle motilitet, der forårsager ændringer i luminal diameter, uden at data om intraluminale trykændringer eller muskelspændinger, og ved genereringen af artefakter baseret på forsøgsopstilling; selv, analysis metoder kan redegøre for disse spørgsmål. Sammenlignet med tidligere teknikker videooptagelse og STmap tilgang giver en mere omfattende forståelse af gastrointestinal motilitet.
Der er udviklet forskellige metoder til registrering og analyse af tarmens motilitet løbet af de sidste 150 år 1. Disse har varieret fra den indledende in vivo-observationer og beskrivelser af William Beaumont og Walter Cannon til de nyere metoder til måling og fortolkning af multisite registrering af muskelspændinger, intraluminale pres, og / eller membran potentiale (dvs. forbindelsesepitoper potentialer) 2 – 6. Disse sidstnævnte tilgange giver et øjebliksbillede af de samlede motilitet mønstre, men er begrænset af antallet af lokaliteter af optagelse og gyldigheden af interpolation af data til områder i mellem optagelsen websteder.
Den seneste udvikling i videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning (STmap) teknikker har gjort det muligt at observere og analysere komplekse motilitet mønstre i ex vivo hele segmenter af tyktarmen og tarm. Indledende tilgange, først beskrevet for intestinal segmenter i slutningen af 1990'erne 7,8, afhang af investigator-designet software til at analysere videooptagelse; flere grupper har nu oprettet eller modificeret software til dette formål 2,8 – 12. Mens mange grupper har genereret deres egne softwarepakker eller plugins, de alle analyserer diametre på et væv segment og konvertere disse forskellige diametre til gråtoner repræsentation. Et kommercielt tilgængeligt registrering og analyse system kaldet gastrointestinal motilitet Overvågningssystem (Gimm) indeholder en nøglefærdig tilgang, der giver mulighed for analyse af både fremaddrivende motilitet via fækal pellet hastighed beslutsomhed i marsvin distale colon 13 samt analyse af fremaddrivende og blande motilitet mønstre med en væske stimulus i intakte tarm segmenter 4,5,14 – 19. Sidstnævnte fremgangsmåde afhænger generering og analyse af STmaps og er beskrevet i dette dokument. Målet med denne fremgangsmåde er at øge tHan evne til kvalitativt og kvantitativt at analysere forskellige tarmmotilitetsmønstrene til stede i tarmen. Mens andre grupper har brugt STmap til motilitet analyse gennem deres egen software, dette er den første beskrivelse af, hvordan du bruger Gimm til at analysere motilitet mønstre ved generering af STmaps. I nærværende papir, vi giver detaljerede trin-for-trin instruktioner om: forberedelse af tarmen væv til videooptagelse, korrekte indstilling af videooptagelse parametre for at maksimere evnen til at opdage ændringer i vævet diameter, oprettelsen af STmaps, samt fortolkning og analyse af STmaps hjælp af Gimm systemet og ImageJ software.
Den her beskrevne fremgangsmåde er specifik for analyse af den luminale perfusion af væsker eller halvfaste stoffer indeholdende forbindelser, som påvirker tarmmotilitet mønstre. Fremgangsmåde til analyse af fækalt pellet fremdrift er beskrevet i en artikel af Mawe og kolleger 13. Den generelle fremgangsmåde beskrevet her kunne væreanvendes på andre rørformede glatte muskelceller organer såsom: tyndtarmen, blodkar, urinrøret, urinledere, etc. Selv om denne fremgangsmåde i sig selv ikke giver oplysninger om ændringer i tryk eller muskelspændinger, kunne det kobles sammen med brugen af pres transducere, krafttransducere eller elektrofysiologiske målinger for at give et mere fuldstændigt billede af motilitet mønstre som nogle andre grupper har vist 2,15,20,21.
Tarmmotilitet er blevet set og beskrevet ud fra en række perspektiver baseret på arten af de parametre registreres. Videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning har vist sig et værdifuldt værktøj, der giver en analyse af den samlede bevægelse og / eller fremdrift over lange segmenter af tarmen samt analyse af aktiviteten på bestemte punkter langs segmentet. Tilgangen til videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning kan være to, og er reflekterende af det undersøgte område, og arten af de luminale indhold. I intestinale segmenter, hvor luminale indhold er mere flydende og i proximal colon, hvor indholdet er mere halvfast, er aktiviteten induceret af intraluminale indførelse af væske ved bolus eller infusion. Spatiotemporale kort fremstillet af disse videooptagelser er designet til at repræsentere bevægelsen af hele segmentet som beskrevet ovenfor. I modsætning hertil i midten til den distale colon, hvor indholdet er mere solide, er aktivitet initieres ved indsættelse af en fækal pellet (epoxy coated pellet naturlige eller kunstigt pellet) og spatiotemporale kort er designet til at afspejle bevægelsen af pelleten gennem tyktarmen som illustreret i JOVE artikel i Hoffman et al. 13. Således opsætningen af eksperimentet og analyse er afgørende og afhænger af typen af stimulus og regionen blev undersøgt. De kritiske trin til generering og analyse af spatiotemporale kort væske-induceret intestinal motilitet er: 1) korrekt fjernelse af mesenterium fra det dissekerede væv; 2) korrekt billede kalibrering før optagelsen; 3) korrekt fjernelse af artefakter i løbet STmap generering og analyse; 4) korrekt opsætning af analysesystem; og 5) at få det håndelag ved selvkaterisation og suturere segmenterne uden at beskadige dem.
Mens anvendelsen af STmaps af luminal diameter har forbedret evne til at visualisere og analysere fuld tarmmotilitetsmønstrene over en region tarmen, er teknikken bedst bruges, når kombineret medfunktionelle målinger af tryk eller muskelsammentrækning 2,15,20. For eksempel, mens nogle muskelsammentrækninger kan ændre luminale diameter lidt og være synlig på nogle STmaps (dvs. myogene krusninger) kan de faktisk ikke forårsage nogen fremdrift eller sammenblanding af tarmindholdet 25. Dette kan ikke være kendt uden kobling af denne teknik til andre funktionelle målinger. Også arten af mange vævspræparater i denne type system (dvs. et lukket system eller luminal konstant luminal perfusion af et pumpesystem) medfører artefakter inden STmaps. Således skal brugeren være opmærksom på, hvordan deres specifikke forberedelse og eksperimentere orgel kan føre til artefakter i de data og måder at undgå eller udelukke disse artefakter i dataanalyse (f.eks mesenterium-induceret lodrette linjer eller mørke pixelering på grund af vævet manglende evne til at uddrive fluid fra systemet i en lukket præparat luminale). Der er flere metoder til luminal perfusion af en itact intestinal segment foruden et lukket system. En metode er at det i stedet et åbent system, som opretholder en konstant intraluminale / modtryk ved hjælp af en hævet rør og / eller envejsventil på anal afslutningen af fremstillingen 8-10,30. Dette gør det muligt for væske til at flytte ud af præparatet under fremaddrivende kontraktioner.
Da systemet er sat primært at konstatere ændringer i luminale diameter, disse sammentrækninger eller motilitet mønstre, der ikke har stor betydning luminale diameter er ofte vanskelige at visualisere denne protokol. Da ændringer i pixel shading i STmap er baseret på ændringer i luminal diameter, vil tarmmotilitetsmønstrene som ikke forårsager store ændringer i diameter visualiseres godt i denne metode, hvis stærke sammentrækninger er også til stede inden for den samme optagelse. Som beskrevet for visualisering og analyse af ripple-typen kontraktion (Figur 3), indstilling analysen linjer i videooptagelsen tættere to vævet væg kan undgå dette problem. Denne metode reducerer den maksimale diameter vises i STmap, så sammentrækninger, der kun minimalt ændre væv diameter kan visualiseres. En anden mulighed for at løse dette problem er ved at ændre varigheden af den video segment analyseret, at udelukke sammentrækninger som i høj grad påvirker luminale diameter, så at mindre sammentrækninger lettere visualiseres. Dette fører til det potentielle problem med motilitet, der minimalt ændrer luminaldiameteren søger ligner en separat STmap hvor sammentrækninger stærkt ændret luminale diameter. Dette skyldes, at fastsættelsen af hvide pixler på kortet er baseret på den mindste diameter i en given video. Hvis der ikke er meget variation i diameter inden for video (lidt eller ingen sammentrækning af cirkulære muskel) meget små sammentrækninger, der ikke ændrer diameteren af præparatet i høj grad kan ligne peristaltiske sammentrækninger fra en anden video. Derfor er det vigtigt at overveje figurenlegende i øverste højre hjørne af kortet. Hvis forskellen mellem de maksimale og mindste diameter er lille, er det vigtigt at sammenligne STmap til videoen blev genereret fra at bestemme gyldigheden af pixel skygge ændring som repræsenteret i STmap. Således undersøgelse af skalalinjen sammenholdt med den egentlige optagelse er afgørende for korrekt fortolkning af kortet.
Videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning af tarm og colon segmenter er blevet anvendt på en række forskellige arter, herunder zebrafisk 26, mus 25,27 – 30, rotte 7,9,30 – 33, marsvin 5,6,8,13 – 19, 24,30,32,34,35, brushtail possum 12,36, kanin 2,30,37,38, kylling 39, gris 40,41 og human 42. De mest undersøgte arter er marsvin. Dette er ikke overraskende, fordi marsvinet enteriske nervesystem hsom er mest fuldstændigt karakteriseret og historisk set har været dyret mest undersøgte in vitro med hensyn til fremaddrivende motilitet af tarmen 43. Spatiotemporal kortlægning har været det meste anvendt på rørformede segmenter af tarmen fra små dyr; Men studier i kanin og svin ved hjælp af modificerede systemer demonstrere anvendelsen af denne metode til større dyr. I tilfælde af kanin, den fremgangsmåde er identisk med mindre dyr, bortset fra at større segmenter og organbade blev anvendt 30. Den anvendte metode i grisen var at anvende en eksterioriseret løkke af tarmen fra en bedøvet gris stedet nedsænkning af en dissekeret væv-segment i et organbad. Også, blev STmaps genereret af krydskorrelation i stedet for gennemlysning anvendte metode i de fleste undersøgelser 40. Den isolerede, vaskulært perfunderet forberedelse loop til videooptagelse og Spatiotemporal kortlægning er også blevet anvendt til mindre arter som rotte <sup> 33. En nylig undersøgelse fra Kuizenga et al. er den første brug af STmaps af video optaget motilitet mønstre i ex vivo-segmenter af den menneskelige tarm 42; selv, STmapping tilgange er blevet anvendt til analysen af manometriske (tryk) optagelser i mennesker in vivo 3,44. De registrerede tarmmotilitetsmønstrene i humant væv svarer til dem, som allerede er registreret i dyremodeller ved anvendelse af lignende teknikker og validere en udvidelse af denne fremgangsmåde til humane væv. Det er bemærkelsesværdigt, at denne undersøgelse kombinerede STmaps afledt af videooptagelser med måling af muskelkontraktion registreret af krafttransducere. Måling af intraluminale tryk ved et fiberoptisk manometrisk kateter indsat i ex vivo-segmentet blev også omdannet til et STmap, viser alsidigheden af STmap at visualisere mere end ændringer i luminal diameter. Dette kombineret tilgang korrelerer muskelspændinger, giver intraluminalt tryk og væg bevægelsefor en mere dybdegående funktionel analyse af de STmaps genereret fra videoen rekord.
Studier af STmaps genereret fra væg bevægelser og ændringer i luminale diameter (også kaldet Dmaps) har tilladt detaljerede beskrivelser af motilitet mønstre såsom fremaddrivende peristaltiske bølger og lokaliserede segmenter sammentrækninger. Mens disse mønstre blev identificeret ved tidligere eksperimentelle metoder, den nuværende tilgang tillader en mere detaljeret definition af lokaliserede kontraktile bevægelser som krusninger og nye anti-peristaltiske sammentrækninger 9,24,25,30,31,42. Opførelsen af STmaps og analyse af udviklingen i motilitet mønster er blevet anvendt på centrale spørgsmål i gastrointestinale motilitet af tarmen og kolon. Disse omfatter: differentiering af neurogene og myogene sammentrækninger og definere den rolle, interstitielle celler af Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 – 31,33,37 – 40,42, forstå komplekseinteraktioner mellem de cirkulære og langsgående muskellag 2,7,8,11,12,32,39,40, der undersøger effekten af intraluminale næringsstoffer 10,18,19, mikrobielle stammer 34, og viskositeter 12,36 på forskellige motilitet mønstre, og forstå den rolle, som forskellige endogene neurohormonale agenter og eksogene farmakologiske midler 2,4 – 7,9,10,13 – 17,28,35,40 i genereringen og ændring af motilitet. Fremtiden for denne teknik indebærer at koble det med andre målinger, herunder tryk, elektrofysiologi og spændinger / kontraktilitet. Nylige undersøgelser har ofte inkorporeret et eller flere af disse målinger i forbindelse med videooptagelse og spatiotemporale kortlægning for at tilvejebringe yderligere detaljer korrelative 2,42. Endvidere kan systemet anvendes til at måle motiliteten i andre rørformede og ikke-rørformede organer. For eksempel har der været gjort forsøg på at måle gastrisk motilitet ved hjælp afet sådant system, men teknikken og software brug raffinement til bedre at kvantificere motilitet i sådan en ikke-rørformet organ 45. Der er ingen tvivl om, at brugen af spatiotemporale teknikker kortlægning alene og i kombination med mere traditionelle analysemetoder vil føre til en mere dybdegående og omfattende forståelse af gastrointestinal motilitet i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
DMK blev støttet af et IRACDA bevilling fra NIGMS (K12GM093857) til Virginia Commonwealth University. Dette arbejde blev støttet af NIDDKD tilskud DK34153 til John R. Grider.
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
Carboxygen (95%O2/5%CO2) | |||
Dissecting pins | |||
Dissecting trays/dishes | |||
Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
Organ Baths | Included with GIMM. | ||
Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |