Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativamente cellule staminali somatiche quiescenti sostenere il rinnovamento cellulare per tutta la vita nella maggior parte dei tessuti adulti. Le cellule staminali neurali nel cervello dei mammiferi adulti sono limitate a due specifiche nicchie neurogena: la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo e la zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ, chiamato anche zona subependimale o SEZ) nelle pareti del laterali ventricoli. Lo sviluppo di strategie in vivo di trasferimento genico per le popolazioni di cellule staminali adulte (cioè quelli del cervello dei mammiferi) con conseguente espressione a lungo termine di transgeni desiderati nelle cellule staminali e la loro progenie derivata è uno strumento cruciale nella corrente ricerca biomedica e biotecnologica. Qui, un metodo diretto in vivo è presentato per la modificazione genetica stabile di cellule di topo adulto V-SVZ che sfrutta la cella infezioni ciclo-indipendente LV e la citoarchitettura altamente specializzato della nicchia V-SVZ. In particolare, l'attuale protocollo comportas l'iniezione di LV vuoti (controllo) o LV codificanti cassette specifica espressione del transgene nelle memorie V-SVZ sé, per in vivo di targeting di tutti i tipi di cellule nella nicchia, o nel lume ventricolo laterale, per l'orientamento dei ependimali solo le cellule. cassette di espressione vengono poi integrati nel genoma delle cellule trasdotte e proteine ​​fluorescenti, codificate anche dal LV, permettere la rivelazione delle cellule trasdotte per l'analisi di cellule, effetti autonomi e non autonomi nicchia-dipendente sulle cellule marcate e loro progenie.

Introduction

La zona ventricolare-subventricular murino (V-SVZ), nelle pareti del ventricolo laterale rivolta verso lo striato, è una regione germinale molto attivo in cui un processo continuo di replicazione delle cellule progenitrici e differenziazione risultati nella produzione persistente bulbo olfattivo (OB ) interneuroni e oligodendrociti corpo calloso ^1. La generazione per tutta la vita di queste cellule sembra essere sostenuta dalla presenza in questa regione di cellule neurali staminali (NSC; anche chiamate cellule B1), che esprimono l'antigene astrociti proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) e gambo marcatori di cellule, come nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-cellule che esprimono B1 generare cellule (TAP) (cellule C), che esprimono fattori di trascrizione Dlx2 transito amplificando progenitore (distale-meno homeobox 2) e Ascl1 (mammiferi achaete-Schute omologo 1) e dividere rapidamente un paio di volte prima che danno luogo a neuroblasti migrazione (cellule a) o oligodendroblasts ^3. Appena generata prolifneuroblasti migrano rative anteriormente, formando il flusso migratorio rostrale (RMS) per l'OB, in cui si integrano nel granulari e strati glomerulare come interneuroni inibitori differenziati. Migrazione giovani oligodendroblasts muovono al CC, dove diventano cellule NG2-positive immature che continuano a dividere localmente o differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti maturi ^1,4.

celle B1, che derivano da cellule gliali radiali fetali, conservano la morfologia allungata e polarizzata dei loro predecessori e presentano un rapporto altamente specializzato con la loro nicchia. Essi spaziano tra il ependima che allinea il ventricolo e la rete di vasi sanguigni che irrigano la nicchia V-SVZ. Il piccolo processo apicale delle cellule B1 intercala tra ependymocytes multiciliated e termina in un singolo ciglio primario non mobili, mentre il loro processo basale si estende lunghe distanze per avvicinarsi il plesso vascolare planare che irriga questo finale nicchia nel BAsal lamina dei capillari del plesso ^2,5-8.

Il modo più affidabile per distinguere B1-NSC da astrociti non neurogena, che sono anche GFAP ^+, nella nicchia V-SVZ intatto si basa sulla preparazione della parete laterale del ventricolo e la loro analisi del 3-D microscopia confocale tutto il montaggio dopo immunocolorazione per GFAP per etichettare il sottile processo apicale B1-NSC, β-catenina a delineare le membrane cellulari, e sia γ-tubulina come marcatore di corpi basali cilial o acetilata α-tubulina di etichettare l'entità di ogni ciglio ^5,8. Le osservazioni di questi interi-monti dalla superficie ventricolare hanno indicato che le cellule B1 e ependimali sono disposti in "girandole" ^5, in cui i processi apicali uniciliated di uno o più GFAP ^{+ B1} cellule sono circondate da una rosetta di cellule ependimali multiciliated.

La morfologia caratteristica delle cellule B1 correla con l'evidenza sperimentale indicating che i vasi sanguigni / cellule endoteliali e ventricolare liquido cerebrospinale (CSF) costituiscono fonti regolamentati di segnali solubili che agiscono su NSC ^2,6,9-11. In superficie ventricolare, omotipica e le interazioni apico-laterale eterotipica che coinvolgono cellule ependimali e B1 comprendono giunzioni strette e giunzioni aderenti ^5,12. Inoltre, molecole di adesione coinvolte nei complessi giunzionali tra cellule B1 e ependimali, come N-caderina e V-CAM, hanno dimostrato di regolare non solo il posizionamento altamente organizzato di B1 nella nicchia V-SVZ, ma anche la loro quiescenza ^{12 , 13.} Il monostrato di cellule ependimali-B1 sembra agire come barriera di diffusione che consente il flusso regolamentato di acqua e piccole molecole dal CSF, ma limitando il passaggio intercellulare grandi proteine ^​​10,11. Evidenze sperimentali indicano che la posizione unica ciglio apicale delle cellule B1 potrebbe svolgere un ruolo di sensore di segnalazione polipeptidi presenti nel liquor ^2,5-7. Cellule ependimali sono, di per sé, anche una sorgente di segnali solubili e di membrana con un ruolo nella regolazione del comportamento NSC ^14,15.

Nucleosidi tracciabili, come bromo-deossiuridina (BrdU), o retrovirus sono stati ampiamente utilizzati per marcare le cellule progenitrici, tra NSC, in vivo. Tuttavia, questi metodi non sono ottimali per il destino tracciamento a lungo termine, perché i segnali BrdU diluito attraverso divisioni cellulari ripetuti e retrovirus sembrano indirizzare preferenzialmente transitoriamente amplificare le cellule a causa della loro esigenza di proliferazione delle cellule per la trasduzione ^16,17. Per esaminare NSC fisiologia in vivo, comprese le interazioni con i componenti di nicchia, è fondamentale stabilire un metodo per etichettare e tracciare le cellule raramente che dividono, come B1-NSC sono in gran parte a riposo e le loro cellule ependimali vicini non si dividono in condizioni fisiologiche ^3. Qui, dimostriamo che vettori lentivirali (LV) consentono di marchio gene ad alta efficienzazione e modifica a lungo termine di NSC adulti e non dividendo le cellule ependimali, causa più ragionevolmente alla loro capacità di trasdurre e di integrarsi nel genoma delle cellule bersaglio in modo indipendente ciclo cellulare. Inoltre, si mostra come il percorso di consegna e virali aiuto titolo di trasdurre specificamente cellule ependimali, ma non le cellule B1 consentendo in tal modo l'analisi di nicchia-dipendente, effetti ependimali su NSC.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Valencia in conformità con la direttiva europea 2010/63 / UE. 1. Generazione di LV per In Vivo marcatura studi (si veda la Figura 1a) ATTENZIONE: La procedura qui descritta è livello di biosicurezza 2, eseguire quindi tutte le seguenti procedure in una cappa di rischio biologico. Assicurare che il personale di ricerca sono adeguatamente qualificato e preparato in tut…

Representative Results

Sistema di erogazione gene LV-mediata può essere utilizzato per il lungo termine in vivo trasduzione di cellule nel topo adulto V-SVZ, permettendo loro di inseguimento e modificazione genetica durante la proliferazione, la migrazione e la differenziazione. L'infezione e l'espressione sono altamente efficaci e producono numerose cellule che possono essere facilmente distinta tra le altre cellule non infette con l'espressione del reporter incluso. Abbiamo finora visualizzato cellule trasdotte con i g…

Discussion

LV offrono importanti vantaggi rispetto ad altri sistemi virali per la modificazione genetica degli adulti NSC ^16,18. consegna stereotassica del lentivirus alla nicchia V-SVZ rappresenta un metodo efficace per etichettare e tracciare rado dividendo B1-NSC superare i limiti di altri metodi di uso comune come BrdU, che è diluito dopo molteplici divisioni cellulari, o retrovirus, che prendono di mira solo le cellule che proliferano al momento dell'applicazione. LV, insieme con adenovirus, può infettare le …

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations