ग्लयोब्लास्टोमा के लिए एक असुरक्षित पशु मॉडल की bioluminescence इमेजिंग
Summary
GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.
Abstract
In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.
Introduction
Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syngeneic असुरक्षित C57BL / 6 चूहों में प्रत्यारोपित intracranially जब GL261 murine तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं, मानव तंत्रिकाबंधार्बुद जेनोग्राफ्ट पशु मॉडलों की तुलना में कई लाभ प्रदान करते हैं। Xenografted ट्यूमर से कई सटीक रूप से आक्रामक मानव रोग पुनरावृत्ति नहीं है कि समझाया घावों के रूप में विकसित। इसके विपरीत, GL261 ट्यूमर न केवल आसन्न मस्तिष्क में आक्रमण को दर्शाता है, लेकिन यह भी neovascularization, mitotic आंकड़े, और गहरा नेक्रोसिस 7। सबसे महत्वपूर्ण बात यह ट्यूमर इम्यूनोलॉजी या immunotherapeutic रणनीतियों 15, 16, C57BL 6 / माउस एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली को 8 को बरकरार रखे हुए अध्ययन करते। पिछले अध्ययनों प्रतिरक्षादमनकारी साइटोकाइन TGF-β के मजबूत अभिव्यक्ति से पता चला है और intracranial ट्यूमर मानव ग्लियोब्लास्टोमा 9, 10 के लिए इसी तरह प्रतिरक्षादमनकारी टी नियामक सेल होते हैं।
यहाँ वर्णित सरल तकनीक GL261 कोशिकाओं द्वारा luciferase की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। हमने हाल ही में सिमी की सूचना दी हैइन विट्रो में और GL261 कोशिकाओं की तुलना में GL261.luc कोशिकाओं के vivo विकास में लोकप्रिय है, इसी तरह के ट्यूमर histologic विशेषताओं और प्रतिरक्षा सेल के अलावा 17 घुसपैठ। GL261.luc कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक फोटॉनों और इसलिए पता लगाने योग्य प्रकाश में रासायनिक ऊर्जा में परिवर्तित सब्सट्रेट luciferin के ऑक्सीकरण उत्प्रेरित जो luciferase व्यक्त करते हैं। Luciferin सुरक्षित रूप से जानवरों को दिलाई और intraperitoneal या नसों में इंजेक्शन के बाद रक्त मस्तिष्क बाधा पार किया जा सकता है। चूहों जैसे छोटे अनुसंधान पशुओं में, bioluminescence एक गैर आक्रामक तरीके से 11 में बाहर से पता लगाया जा सकता है। इसलिए, ट्यूमर के विकास को क्रमानुसार पशु बलि या महंगा एमआरआई या सीटी इमेजिंग के लिए आवश्यकता के बिना मूल्यांकन किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम किसी भी इन विवो प्रयोगों की शुरुआत से पहले इन विट्रो में, lentiviral पारगमन, लेकिन यह भी luciferase की स्थिर अभिव्यक्ति का सत्यापन न केवल शामिल है। पारगमन की हानि requi सकता हैदोहराने lentivirus के संक्रमण फिर से। अभिव्यक्ति वेक्टर में एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का परिचय भी luciferase अभिव्यक्ति के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सावधानीपूर्वक तकनीक reproducibly अलग उपचार समूहों की तुलना की अनुमति के लिए एक सटीक शारीरिक स्थान में कोशिकाओं के अनुरूप एक नंबर करने के लिए जगह intracranial आरोपण के लिए आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन और luciferase व्यक्त GL261 कोशिकाओं के पिछले अध्ययनों के बीच एक बड़ा अंतर यह है कि एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम 18 के उपयोग की तुलना में कोशिकाओं को दाखिल करने के लिए एक मुक्त हाथ तकनीक का इस्तेमाल होता है। हम पहले से मुक्त हाथ तकनीक 19 के साथ संगत कर आरोपण परिणामों का प्रदर्शन किया है। मुक्त हाथ तकनीक का लाभ विभिन्न उपचार एजेंटों के उच्च throughput विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता है। हमारे हाथ में है, हम एक घंटे में लगभग 60 जानवरों प्रत्यारोपण कर सकते हैं।
तकनीक माहिर के बाद, तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों असीम हैं। GL261 demonstr के रूप मेंAtes ऊंचा mitoses और मानव ग्लियोब्लास्टोमा के लिए इसी तरह तेजी से ट्यूमर के विकास, विरोधी proliferative उपचार का मूल्यांकन किया जा सकता है। GL261 ट्यूमर आक्रामक और वाहिकाजनक के रूप में इसी तरह, विरोधी आक्रामक और विरोधी वाहिकाजनक उपचारों का इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव लक्ष्य के उद्देश्य से एजेंटों के प्रभाव का आकलन करते समय सावधानी से किया जाना चाहिए। Luciferase 20 व्यक्त मानव ग्लियोब्लास्टोमा xenografts उपयोग पिछले अध्ययनों की तुलना में, यह हमारे मॉडल की एक सीमा पर विचार किया जाएगा। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास की immunotherapeutic रणनीतियों के प्रभाव GL261 xenografted मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.
Materials
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
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