Nauwkeurige en Fenol Gratis DNA Sexing van Dag 30 embryo's van varkens door PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

Onderzoek naar prenatale programmering van het varken blijkt dat het geslacht van de ontwikkelende embryo of de foetus de ontwikkelingsuitkomst kan beïnvloeden. Daarom is de mogelijkheid om het geslacht een embryo te bepalen moet in veel experimenten name wat vroege ontwikkeling. Dit protocol toont een goedkope, snelle en niet-toxische bereiding van varkens genoom DNA voor PCR. Dag 30 embryo's moeten op humane wijze worden verzameld op basis van de door Institutional Animal Welfare Policy en commissies voor het huidige protocol richtlijnen. De bereiding van het gehele embryo van dit PCR-gebaseerde techniek omvat geslachtsbepaling gewoon malen van het bevroren embryo tot een fijn poeder met een vooraf gekoelde mortier en stamper. PCR-kwaliteit DNA wordt vrijgemaakt uit een kleine hoeveelheid embryo poeder door een hete incubatie in een alkalische lysis reagens. Vervolgens wordt de DNA-oplossing gemengd met neutralisatiebuffer en direct gebruikt voor PCR. Twee primerparen worden gegenereerd om DETECt bepaald geslacht bepalend gebied van het Y-chromosoom (SRY) en omgeving ZFX van de X-chromosoom met een hoge nauwkeurigheid en specificiteit. Hetzelfde protocol kan worden toegepast op andere langwerpige embryo (dag 10 tot dag 14) vroegste Dag 30. Ook kan dit protocol worden uitgevoerd met 96-borrelde platen bij het screenen van een groot aantal embryo's, waardoor het mogelijk voor automatisering en high- throughput sex typen.

Introduction

De binnenlandse varken is een fundamenteel onderzoek onderwerp in ontwikkeling, genetica en voeding in zowel menselijke en dierlijke sectoren geworden. Het potentieel van varkens biomedische modellen voor menselijke onderzoek kan worden toegeschreven aan de fysiologische gelijkenissen. In vee, kan de manipulatie van sex-ratio van de effectiviteit van de selectie en genetische verbeterprogramma's ¹ te verbeteren. Geslachtsbepaling individuele embryo is een fundamenteel gereedschap in vele experimentele onderzoeken waaronder maar niet beperkt tot genotype, epigenetica en X inactivatie van geslachtsdimorfisme tijdens de vroege embryonale ontwikkeling ^2.

Studies in muizen wijzen erop dat de moeder voeding en andere factoren kunnen leiden tot genderongelijkheid ^3. Bij varkens oorzaken van sex-ratio onbalans onder vaderlijke ras ^4, baarmoeder capaciteit ^5, en de zeug metabole ^voorwaarde 6. Waarbij de verschillen waargenomen in embryo's en nesten kan worden beïnvloed door sexual dimorfisme, moeten onderzoekers zich bewust zijn van embryo sex en sex ratio's alvorens conclusies te trekken ten aanzien van hun onderzoek. De ontwikkeling van efficiënte instrumenten en protocollen voor geslachtsbepaling varken embryo's op dag 30 van de ontwikkeling zal hier worden besproken.

Verscheidene werkwijzen van geslacht typen zijn ontwikkeld voor genetische studies in modelorganismen en vee. Met name in de veehouderij, het identificeren van de mannelijke en vrouwelijke vroege embryo's is een veel voorkomende praktijk genetische selectie te verbeteren voor fokprogramma's. Vroege embryo karyotypering in varkens gebruik Giemsa ⁷ of intense fluorescentie ^8,9 technieken gebruikt voor seks typen. Deze werkwijzen zijn tijdrovend en niet geschikt voor het screenen van grote aantallen embryo's snel en nauwkeurig.

De meest effectieve sex typeringsmethode DNA amplificatie met behulp van een warmtestabiel DNA polymerase en een paar primers. Geslachtsbepaling DNA door PCR methode is specifiek, snelle en gevoelige, olleen die een minieme hoeveelheid van cellulaire materialen. De eerste PCR-gebaseerde embryo geslachtsbepaling werd uitgevoerd op mensen ^10, en later in muizen ^11, vee ^12, buffels ^{13 en 14} schapen pre-implantatie embryo's. In het varken, werd de eerste DNA geslacht typeringsmethode vastgesteld voor pre-implantatie embryo's via een enkel paar Y-chromosoom specifieke DNA primers ^15. Echter, de meest voorkomende PCR primers voor geslachtsbepaling werden geselecteerd uit het Y-chromosoom specifieke mannelijke SRY gen ¹⁶ en de niet-sekse discriminerende gebied van een zinkvinger gen aan beide X- en Y-chromosoom ^17. Vervolgens werden deze primers toegepast op het geslacht van dag 30 embryo's in deze studie met een verbeterde specificiteit van de primers bepaalt alleen de X- chromosoom van een zinkvinger gen detecteren.

Genomisch DNA uit varken pre-implantatie embryo kan worden geëxtraheerd door het blootstellen van een intact blastocyst buffer met proteinase K ¹⁶ of door middel van een biopsie van een aantal cellen van het individu vroege embryo splitsing ¹⁵ en het gebruik voor directe PCR. Echter, introductie van DNA uit varkensbloed, haar, weefsel of een grote conceptus over enkele centimeters groot is niet effectief gedaan met behulp van proteinase K methode. DNA-extractie voor deze materialen werden vastgesteld met behulp van tijdrovende fenol / chloroform protocollen ⁶ of dure kolom gebaseerde kits ^18. Om het gebruik van potentieel toxische stoffen te vermijden, is er een trend om goedkoop, eenvoudig en fenol-vrij DNA extractie te ontwikkelen. Dit type protocol voor de isolatie van PCR-kwaliteit genomisch DNA van de muis ¹⁹ en ²⁰ zebravis weefsels werd vastgesteld met behulp van hete natriumhydroxide en Tris (HOTSHOT). Deze studie geeft een protocol om DNA te verkrijgen met gemodificeerde hotshot en vernieuwde duplex primerparen voor de PCR sex direct te typen van cellysaten van de Dag 30 embryo's van varkens methoge nauwkeurigheid.

Protocol

In overeenstemming met de Canadian Council on Animal Care richtlijnen en met instemming van de faculteit Animal Welfare Policy en Committee – Vee van de Universiteit van Alberta, werden drachtige zeugen gedood door geschoold personeel op ongeveer dag 30 van de zwangerschap en embryo's werden verzameld. Gebruik onderzoekshandschoenen te allen tijde gedurende de procedures. 1. Sample Collection en Sample Storage Euthanaseren zeug met behulp penschiettoestel gevolgd door verbloeding. Draag onderzoeks…

Representative Results

Een representatief resultaat van geslachtsbepaling van 345 DNA lysaten screening door PCR wordt getoond in Figuur 7 en samengevat in tabel 1. Zoals te zien in figuur 7, de primers annealing temperatuur 65 ° C is de optimale conditie in het PCR-protocol genereren gelijke intensiteit en voorspelde amplicon groottes (figuur 5) tussen verschillen…

Discussion

De meeste bestaande protocols gerelateerd aan varkensembryo's sex DNA typering zijn alleen geschikt voor beginnende pre-implantatie fase ^15,16. We hebben met succes een protocol geschikt is voor varkens embryo screening ontwikkeld tijdens de late zwangerschap. Gebaseerd op studies met gelijke ontwikkelingsstadia van embryo's uit eerdere studies ^6,18, is de onderhavige protocol als veiliger en lage kosten.

Dit protocol is geschikt voor een groot aantal monsters v…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.