Preciso e fenolo DNA Sexing libera del Giorno 30 suina embrioni mediante PCR
Summary
This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.
Abstract
La ricerca sulla programmazione prenatale nel maiale ha dimostrato che il sesso dell'embrione in via di sviluppo o il feto può influenzare il risultato dello sviluppo. Pertanto, la capacità di determinare il sesso di un embrione è necessario in molti esperimenti particolarmente per quanto riguarda lo sviluppo iniziale. La presente protocollo dimostra una preparazione poco costoso, rapido e non tossica di maiale DNA genomico per l'uso con PCR. Giorno 30 embrioni devono essere umanamente raccolti secondo le linee guida stabilite dal Istituzionale politica degli animali e dei Comitati Welfare per il presente protocollo. La preparazione di tutta embrione di questa tecnica sessaggio PCR comporta semplicemente macinazione l'embrione congelato per una polvere fine con una malta pre-raffreddata e pestello. DNA PCR-qualità è rilasciato da una piccola quantità di polvere embrione applicando una incubazione caldo in un reagente di lisi alcalina. Successivamente, la soluzione di DNA viene miscelata con il tampone di neutralizzazione e utilizzato direttamente per PCR. Due coppie di primer sono generati al DATECdeterminato sesso t determinazione regione del cromosoma Y (SRY) e regione ZFX del cromosoma X con elevata precisione e specificità. Lo stesso protocollo può essere applicato ad altri embrioni di forma allungata (10 ° giorno al 14 ° giorno) più di giorno 30. Inoltre, questo protocollo può essere effettuato con piastre a 96 sgorgava quando lo screening di un gran numero di embrioni, rendendo così possibile per l'automazione e di alta tipizzazione del sesso il throughput.
Introduction
Il maiale domestico è diventato un soggetto di ricerca fondamentale nello sviluppo, la genetica e l'alimentazione in entrambi i settori umani e del bestiame. Il potenziale dei suini come modelli biomedici per la ricerca umana può essere attribuito alla loro somiglianze fisiologiche. Nel bestiame, la manipolazione del rapporto tra i sessi può migliorare l'efficacia di selezione e miglioramento genetico programmi 1. Sexing singoli embrioni è uno strumento fondamentale utilizzato in molte indagini sperimentali inclusi ma non limitati al genotipo, epigenetica e X inattivazione di dimorfismo sessuale durante lo sviluppo embrionale precoce 2.
Studi nei topi suggeriscono che la dieta materna e altri fattori possono causare squilibrio di genere 3. Nei suini, cause di rapporto tra i sessi squilibrio includono razza paterna 4, la capacità uterina 5, e la condizione metabolica della scrofa 6. Dal momento che le differenze osservate negli embrioni e cucciolate possono essere influenzati da séxual dimorfismo, i ricercatori devono essere consapevoli del sesso dell'embrione e rapporti sessuali prima di trarre conclusioni per quanto riguarda la loro ricerca. Lo sviluppo di strumenti e protocolli efficienti per sessaggio degli embrioni di maiale al giorno 30 di sviluppo sarà discusso qui.
Vari metodi di tipizzazione del sesso sono stati sviluppati per studi di genetica in organismi modello e bestiame. In particolare nel bestiame, individuando maschili e femminili embrioni precoci è una pratica molto comune per migliorare la selezione genetica per programmi di allevamento. I primi embrioni cariotipo nel maiale con Giemsa 7 o l'intensa fluorescenza 8,9 tecniche sono state utilizzate per la tipizzazione del sesso. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e non è adatto per lo screening gran numero di embrioni modo rapido e preciso.
Il metodo di tipizzazione sesso più efficace è l'amplificazione del DNA mediante una stabile al calore DNA polimerasi e una coppia di primers. sessaggio DNA mediante PCR è più specifico, rapido e sensibile, oolo che richiede una quantità minima di materiali cellulari. Il primo embrione sessaggio PCR-based è stata eseguita su esseri umani 10, e poi in topi 11, bovini, bufali 12 13 e pecore 14 embrioni pre-impianto. Nel maiale, il più antico metodo di tipizzazione del DNA sesso è stato stabilito per gli embrioni pre-impianto attraverso una singola coppia di cromosoma Y primer DNA specifico 15. Tuttavia, i primer PCR più comuni per la determinazione del sesso sono stati selezionati dal cromosoma Y del maschio specifico gene SRY 16 e la regione discriminativa non sesso di un gene zinc-finger posti sui lati X e Y cromosoma 17. Successivamente, questi primer sono stati applicati per determinare il sesso del giorno 30 embrioni in questo studio con una migliore specificità dei primers per rilevare solo il cromosoma X di un gene zinc-finger.
DNA genomico da suini embrioni pre-impianto può essere estratto esponendo una blastocisti intatto di tamponare con proteinase K 16 o prendendo una biopsia di alcune cellule dal singolo scissione precoce embrioni 15 e li utilizzano per la PCR diretta. Tuttavia, rilascio di DNA da sangue suino, capelli, tessuti o un grande conceptus sopra alcuni centimetri di dimensione non è effettivamente fatto usando il metodo di proteinasi K. Metodi di estrazione del DNA per questi materiali sono stati stabiliti utilizzando sia in termini di tempo protocolli di fenolo / cloroformio 6 o kit basati costoso colonna 18. Per evitare l'uso di sostanze chimiche potenzialmente tossiche, vi è una tendenza a sviluppare economici, metodi di estrazione del DNA facile e senza fenolo. Questo tipo di protocollo per l'isolamento di DNA genomico PCR qualità di topo 19 e 20 zebrafish tessuti è stata stabilita utilizzando idrossido di sodio calda e Tris (Hotshot). Questo studio fornisce un protocollo per ottenere DNA con modificati Hotshot e ridisegnato coppie di primer per PCR duplex sesso digitando direttamente dai lisati cellulari di Giorno 30 embrioni di suini conalta precisione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La maggior parte dei protocolli esistenti relativi alla suina embrioni DNA tipizzazione sesso sono adatti solo per la fase precoce fase di pre-impianto 15,16. Abbiamo sviluppato con successo un protocollo adatto per lo screening degli embrioni suini durante la tarda gestazione. Sulla base di studi con simili fasi di sviluppo di embrioni da studi precedenti 6,18, il presente protocollo è considerato più sicuro ea basso costo.
Questo protocollo è adatto anche per un gr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere la cooperazione e contributi finanziari della seguente agenzia di finanziamento della ricerca: Alberta bestiame e della carne Agenzia Ltd, CRC carne di maiale, carne di maiale Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Società e NSERC CRSNG.
Materials
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used – quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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