في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة الميثيل (PEMT) إنزيمات تحفز مرفق التساهمية من واحد أو أكثر من مجموعات الميثيل باستخدام S -adenosylmethionine (SAM) بوصفه المانح مجموعة الميثيل على PE، monomethyl-PE أو ثنائي ميثيل-PE لإعطاء monomethyl-PE، ثنائي ميثيل-PE و / أو فسفاتيديل (PC). هذه الأنزيمات هي في كل مكان تقريبا في الخلايا الحيوانية والفطريات. كما يمكن العثور عليها في بعض النباتات ^{(1) وحوالي} 10٪ من البكتيريا، لا سيما تلك التي تتفاعل مع حقيقيات النوى ^2.

PEMTs ذات الصلة بيولوجيا الخلية ليس فقط عن طريق المساهمة في إنتاج أجهزة الكمبيوتر الشخصية، التي هي الطبقة الدهنية الأساسية في الخلايا الحيوانية، ولكن أيضا عن طريق الوفاء الوظائف الخلوية الهامة الأخرى. في الثدييات، ويتم التعبير عن PEMTs أساسا في الكبد حيث كانت مطلوبة من أجل إفراز طبيعي من البروتين الدهني منخفض الكثافة جدا، وأنها تسهم أيضا في النظام الغذائي الناجم عن السمنة ^{3، 4} تصلب الشرايين، والأنسولين مقاومة⁵ تعصب. بالإضافة إلى ذلك، أعرب PEMT الثدييات أيضا في الخلايا الشحمية، على الرغم من أن مستويات أدنى، والمشاركة في ترسب الدهون ^{6 و 7.} كما تم أظهرت دور PEMT في تطور مرض السرطان ^{8، 9} موت الخلايا المبرمج، ونمو الخلايا ^10. في البكتيريا، وقد تبين أن الأنزيمات PEMT إلى أن تكون مهمة للنمو الطبيعي الخلية ^{2، 2} الفوعة، والتعايش مع النبات المضيف ^(11).

الهدف والأساس المنطقي لهذا البروتوكول هو قياس النشاط PEMT من مقتطفات خلية كاملة دون الحاجة لتنقية الانزيم. وقد وضعت بروتوكولين متميزة لقياس النشاط PEMT. واحد الأول والأكثر شيوعا يقيس نقل مجموعة الميثيل معالج بالتريتيوم من SAM المشع على PE، الذي هو موضوع هذا المقال. وقد تم هذا البروتوكول وضعت أصلا لقياس النشاط PEMT من الخميرة ¹² وخلايا الثدييات (الكبد) ¹³ لاكتساب understاندينج من الحيوي PC في هذه الخلايا وكذلك لتحديد خصوصية هذه الإنزيمات. وفي وقت لاحق، وقد تم تطبيق هذه التقنية لأنواع الخلايا الأخرى مثل البكتيريا ² (باستخدام قيمة الرقم الهيدروجيني الأساسية للمقايسة على الرغم ¹⁵⁾ والطفيليات ^14. هذه التقنية يمكن استخدامها مع مقتطفات خلية كاملة وكذلك انزيم المنقى، ويحتمل أن يكون تطبيقها على أي نظام استخراج الخلايا. كما تم تصميم مقايسة غير المشع الذي يعتمد على القياس الكمي الأنزيمي S -adenosylhomocysteine، والمنتج نقل الميثيل من SAM ^16. قد يكون الفحص الأخير أكثر ملاءمة لأنها لا تنطوي على النشاط الإشعاعي لكنه لا يصلح إلا للأنزيمات تنقيته.

Protocol

1. خلية التحضير استخراج تنمو الخلايا الليشمانيا في زجاجة بلاستيكية معقمة مختومة مع الهواء غطاء محكم على 26 درجة مئوية في المتوسط ​​مصنوعة من 1X M199 تستكمل مع 20 ملي HEPES pH7.4، 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتو?…

Representative Results

ويبين الشكل 1 وقت الفحص PEMT المعالين، التي أجريت مع الليشمانيا استخراج خلية كاملة كمصدر للإنزيم باستخدام PE الذاتية باعتبارها الركيزة. وكان كميا مقدار النشاط الإشعاعي في المرحلة العضوية من قبل التلألؤ العد. واستخدمت الأرقام ا?…

Discussion

هذا بسيط، PEMT سريع الفحص يسمح الكمي من أشكال مثيلة من PE التي تنتج من نقل مجموعات الميثيل المشعة من SAM على PE باستخدام استخراج خلية كاملة كمصدر للبروتين. فهي سريعة وحساسة، قابلة للتكرار، ومناسبة أيضا لأنزيمات النقاء ^17. Monomethyl- أو ثنائي ميثيل-PE يمكن أن تضاف إلى فحص إذ?…

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C