Een hersentumor / organotypische Slice Co-cultuur voor het bestuderen tumor micro en Gerichte Drug therapieën

Summary

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.  

Abstract

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Introduction

Recent kankeronderzoek is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het identificeren van genetische mutaties, moleculaire en eventuele behandelingen voor verschillende hersentumoren. Ondanks deze vooruitgang, hersentumoren blijft een van de top oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte voor volwassenen en kinderen. Beperkende factoren in hersentumor onderzoek zijn de beperkte beschikbaarheid van primaire patiëntenmonsters en cellijnen en de moeilijkheid bij het repliceren van de unieke en heterogene micro hersenen in toegankelijke experimentele systemen. Voor veel hersentumoren die nodig is om tumorcellen te handhaven in de tijd nog niet bekende condities. Zelfs voor hersentumoren die kunnen worden gekweekt in celsuspensie als neurosferen kunnen kweekomstandigheden beïnvloeden de tumorcellen ^1,2. Inderdaad, de toevoeging van basische fibroblast groeifactor of epidermale groeifactor proliferatie te stimuleren en remmen differentiatie genexpressie ¹ veranderen. Andere werkwijzen voor tumorgroei cel zoalstumor propagatie in muizen via orthotope of subcutane xenograft van tumorcellen waardevol assays, maar beperkt door factoren zoals de tijd van tumorontwikkeling (vooral voor laaggradige tumoren), de kosten en het aantal tumorcellen die kunnen worden geïnjecteerd en bestudeerd . Dus de huidige methoden voor het kweken van menselijke hersenen tumorcellen ontoereikend zijn voor het handhaven van bepaalde typen tumoren, en vaak kunstmatige omgevingen die niet nauwkeurig na te bootsen in vivo tumor omgevingen.

Verschillende soorten pediatrische hersentumoren groeien zeer gespecialiseerde plaatsen binnen de hersenen ^{[3, 4]} en dit waarschijnlijk verschillende micro-omgeving eisen tumorgroei tijdens ^[5]. Dit protocol beschrijft een nieuw systeem waarin cellen die moeilijk te vermeerderen in normale kweekomstandigheden zijn gekweekt kunnen worden in een organotypische brain micromilieu nabootst die in vivo tumorgroei omstandigheden. In dit kwantitatieve assay, fluorescent gelabeldehersentumor cellen worden uitgeplaat op jeugdige hersenen van muizen organotypische plakjes en de tijd gevolgd. Deze test kan worden gebruikt om het effect van de micro op tumorgroei onderzocht, en nieuw geneesmiddel therapieën te testen in een klinisch relevante micro hersenen.

Protocol

Ethiek Verklaring: De volgende procedure waarbij proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door het Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care en gebruik Comite. Alle proefpersonen werk werd beoordeeld door de Institutional Review Board commissies van de Brigham en Women's Hospital en het Dana-Farber Cancer Institute, en door Stanford University voor het juiste gebruik, dat de toestemming op de hoogte werd verkregen van alle proefpersone…

Representative Results

Dit deel illustreert de soort resultaten te verwachten gebruik van de hersentumor / organotypische slice co-cultuur aan regionale micro voorkeur onderzoeken en om nieuwe therapieën te testen. We zien dat de test is ontworpen om de micro-omgeving bij hersentumoren repliceren als weefselorganisatie en proliferatieve toestand van het segment wordt gehandhaafd (figuur 3). We tonen ook aan dat een toename van het aantal tumorcellen aan het segment over de tijd gedeeltelijk kan worden veroorzaakt door de mig…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe hersentumor cellen fluorescent kunnen worden gelabeld en uitgeplaat op een sagittale doorsnede hersenen van een P6 muis en vervolgens gecontroleerd voor een week in cultuur. Deze hersentumor / organotypische slice co-kweek-assay kan worden gebruikt om het effect van regionale micromilieu op aantal tumorcellen te bepalen en kan ook worden gebruikt als een systeem voor het meten van de effectiviteit van nieuwe geneesmiddelen behandelingen humane tumorgroei. Eerdere studies hebben een vergelijkb…

Materials

HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica	N/A
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si	N/A
Image J software	N/A	N/A
5mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)