Une tumeur au cerveau / organotypiques Slice système de co-culture pour l'étude des tumeurs Microenvironnement et ciblée Thérapies de drogue

Summary

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.  

Abstract

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Introduction

Recherche sur le cancer récentes ont fait des progrès significatifs dans l'identification des mutations génétiques, des changements moléculaires et les traitements possibles pour une variété de tumeurs cérébrales. Malgré ces progrès, les tumeurs cérébrales demeurent l'une des principales causes de la mortalité liée au cancer pour les adultes et les enfants. Les facteurs limitants de la recherche sur les tumeurs cérébrales comprennent la disponibilité limitée des échantillons de patients primaires et des lignées cellulaires et de la difficulté à reproduire le microenvironnement cérébral unique et hétérogène dans des systèmes expérimentaux accessibles. Pour beaucoup de tumeurs cérébrales les conditions nécessaires au maintien de cellules tumorales dans le temps ne sont pas encore connus. Même pour les tumeurs cérébrales qui peuvent être cultivées en suspension de cellules comme neurosphères, les conditions de culture peuvent affecter les cellules tumorales ^1,2. En effet, l'addition de facteur de croissance basique des fibroblastes ou un facteur de croissance épidermique pour favoriser la prolifération et la différenciation peuvent modifier inhibent l'expression des gènes ^1. D'autres procédés pour la croissance de cellules tumorales telsque la propagation de la tumeur chez des souris par l'intermédiaire de xénogreffe orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales sont des dosages de valeur, mais sont limités par des facteurs tels que le temps de développement de la tumeur (en particulier pour les tumeurs de bas grade), le coût et le nombre de cellules tumorales qui peut être injecté et étudié . Ainsi les méthodes actuelles pour la croissance des cellules tumorales du cerveau humain sont insuffisantes pour maintenir certains types de tumeurs, et fournissent souvent des environnements artificiels qui ne sont pas étroitement imiter les environnements in vivo de tumeurs.

Types distincts de tumeurs cérébrales pédiatriques poussent dans des endroits hautement spécialisés dans le cerveau ^{[3, 4],} ce qui est susceptible de refléter les exigences du microenvironnement distincts pour la croissance tumorale ^[5]. Ce protocole décrit un nouveau système où les cellules qui sont difficiles à se propager dans des conditions normales de culture peuvent être cultivées dans un cerveau organotypique micro-environnement qui imite dans des conditions de croissance de la tumeur in vivo. Dans ce dosage quantitatif, marqué par fluorescencecellules tumorales du cerveau sont étalées sur des tranches de mineurs organotypiques de cerveau de souris et surveillées dans le temps. Ce test peut être utilisé pour étudier l'effet du microenvironnement sur la croissance tumorale, et de tester de nouveaux traitements médicamenteux dans un microenvironnement cérébrale cliniquement pertinente.

Protocol

Déclaration d'éthique: La procédure suivante impliquant des sujets animaux ont été effectuées en conformité avec les Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par le Comité de protection des animaux et l'utilisation du cancer Dana-Farber institutionnel. Tous les sujets humains travail a été examiné par les comités d'examen institutionnel du Conseil de l'Hôpital Brigham and Women et Dana-Farber Cancer Institute, et par l'Université de Stanford pour …

Representative Results

Cette section illustre le type de résultats à attendre de l'utilisation de la tumeur au cerveau / co-culture organotypique d'enquêter préférence microenvironnement régionale ainsi que de tester de nouvelles thérapies. Nous montrons que le test est conçu pour reproduire le microenvironnement des tumeurs cérébrales, comme l'organisation des tissus et de l'état de prolifération de la tranche est maintenue (Figure 3). Nous démontrons aussi que l'augmentation du nombre de cel…

Discussion

Ce protocole décrit la façon dont les cellules tumorales du cerveau peuvent être marquées par fluorescence et étalées sur une section sagittale de cerveau d'une souris P6 et ensuite suivis pendant une semaine de culture. Ce / organotypique essai tranche de co-culture tumeur au cerveau peut être utilisée pour déterminer l'effet de micro-régional sur le nombre de cellules tumorales et peut également être utilisé comme un système de mesure de l'efficacité de nouveaux traitements médicamenteux su…

Materials

HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica	N/A
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si	N/A
Image J software	N/A	N/A
5mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)