Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie
Summary
Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.
Abstract
Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.
Introduction
Jüngsten Krebsforschung hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von genetischen Mutationen, molekulare Veränderungen und mögliche Behandlungen für eine Vielzahl von Hirntumoren hergestellt. Trotz dieser Fortschritte Hirntumoren bleibt eine der Top-Ursachen von Krebs-Mortalität für Erwachsene und Kinder. Begrenzenden Faktoren in Hirntumorforschung gehören die eingeschränkte Verfügbarkeit der primären Patientenproben und Zelllinien und die Schwierigkeiten bei der Replikation der einzigartigen und heterogenen Hirnmikroumgebung in zugänglichen experimentellen Systemen. Seit vielen Hirntumoren die erforderlich sind, um Tumorzellen zu halten über die Zeit noch nicht bekannten Bedingungen. Selbst bei Hirntumoren, die in Zellsuspension als Neurosphären angebaut werden kann, kann Kulturbedingungen die Tumorzellen 1,2 beeinflussen. Tatsächlich ist die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder epidermaler Wachstumsfaktor, um die Proliferation zu fördern und die Differenzierung inhibieren kann Genexpression 1 verändern. Andere Verfahren zum Wachstum von Tumorzellen wie beispielsals Tumorausbreitung in Mäusen über orthotope oder subkutane Xenotransplantat-Tumorzellen sind wertvolle Assays, werden aber von Faktoren wie Zeit der Entwicklung von Tumoren (insbesondere für Grade Tumoren niedrig), der Kosten und der Anzahl der Tumorzellen, injiziert und untersucht werden können, begrenzt . So aktuellen Methoden zur Züchtung menschlicher Gehirntumorzellen sind für die Aufrechterhaltung bestimmter Tumorarten unzureichend und oft künstliche Umgebungen, die nicht mimisch in vivo Tumor Umgebungen zu tun eng.
Verschiedene Arten von pädiatrischen Hirntumoren wachsen in hoch spezialisierten Stellen innerhalb des Gehirns [3, 4], und dies ist wahrscheinlich unterschiedliche Mikroumgebungsanforderungen für das Tumorwachstum zu reflektieren [5]. Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges System, in dem Zellen, die nur schwer unter normalen Kulturbedingungen ausbreiten, kann in einer organotypischen Hirnmikroumgebung gezüchtet werden, die imitiert Tumorwachstum in vivo Bedingungen. In diesem quantitative Assay fluoreszierend markiertenHirntumorzellen sind auf jugendliche Gehirn der Maus organotypischen Schnitten plattiert und über die Zeit verfolgt. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Wirkung der Mikroumgebung auf das Tumorwachstum zu untersuchen, und um neue Arzneimitteltherapien in einem klinisch relevanten Hirnmikroumgebung zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Gehirntumorzellen können fluoreszenzmarkierte und auf einer sagittalen Hirnschnitt einer P6 Maus beschichtet werden und dann überwacht für eine Woche in der Kultur. Diese Hirntumor / organotypischen Kokultur Test kann verwendet werden, um die Wirkung der regionalen Mikroumgebung auf die Tumorzellzahl zu bestimmen, und kann auch als ein System zur Messung der Wirksamkeit von neuen Medikamenten auf die menschliche Tumorwachstum verwendet werden. Frühere Studien haben eine ähnliche Str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by grants from the NIH (P01CA142536 to RAS, T32CA009361 to DPY) and the Pediatric Low Grade Astrocytoma foundation.
Materials
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |||
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |||
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |||
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |||
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |||
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |||
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |||
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |||
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |||
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |||
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |||
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |||
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |||
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |||
| Vibratome | Leica | N/A | |||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | N/A | |||
| Image J software | N/A | N/A | |||
| 5mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) | |||
References
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