Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Réponse immunitaire efficace dépend de mobilisation rapide des leucocytes du sang vers le site de l'infection ou de blessure. Enquêter la migration des leucocytes in vivo est cruciale pour la compréhension de la base moléculaire de la migration des leucocytes transendotheliale et l'interaction avec l'endothélium vasculaire. Une approche puissante implique microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.
Ici, nous présentons un protocole pour les monocytes et les neutrophiles d'imagerie dans la gfp CR1 / poids iv de la souris injectée avec CX 3 oranges neutrophiles marqués par un colorant avec un microscope confocal inversé. Films time-lapse recueillies auprès de 30 minutes à plusieurs heures d'imagerie permettre à l'analyse du comportement des leucocytes dans les veines mésentériques sous les deux conditions stables et inflammatoires. Nous décrivons également les étapes pour induire localement inflammation des vaisseaux sanguins avec TLR2 / TLR1 agoniste Pam3SK4 et surveiller la subsequent recrutement des neutrophiles et des monocytes.
La technique présentée peut également être utilisé pour contrôler d'autres populations de leucocytes et étudier molécules impliquées dans le recrutement des leucocytes ou la traite à l'aide d'autres stimuli ou des souris transgéniques.
Introduction
Neutrophiles et des monocytes sont des cellules du système immunitaire inné qui circulent en continu dans le sang. Lors de blessure ou d'infection, les signaux inflammatoires induisent diapédèse leucocytaire dans les tissus endommagés et infectés, en entamant le présent mémoire une réponse immunitaire cellulaire 3.1. La rapidité de la mobilisation des leucocytes détermine le résultat positif des réponses immunitaires. Ces processus complexes reposent sur des molécules spécifiques (par exemple, sélectines, des chimiokines de l'endothélium lié) présents sur l'endothélium enflammé qui aident à l'établissement de contacts entre les adhésifs leucocytes circulants et l'endothélium 1-3 .Pour obtenir un aperçu sur les molécules impliquées dans le leucocyte recrutement cascade, il est important de visualiser la cinétique de recrutement de cellules et de suivre le comportement de chaque cellule / population. Une méthode efficace consiste à microscopie intravitale sur des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules d'intérêt.
contenu "> À ce jour, plusieurs approches en utilisant la microscopie intravitale ont été développés à l'image du système vasculaire 4,5. Par exemple, l'imagerie du derme de l'oreille vasculaire ou des veines mésentériques par microscopie confocale intravitale a été utilisé pour identifier le comportement de patrouille de Ly6C murin faibles monocytes et humaine CD14 dim CD16 + monocytes sur la face luminale de vaisseaux sanguins dans des conditions d'état d'équilibre de 6-8. Le modèle de système vasculaire crémaster de la souris est souvent utilisé pour surveiller le comportement des neutrophiles ou Ly6C inflammatoire élevés monocytes dans des conditions inflammatoires ou ischémiques chez les souris transgéniques. Dans ce cas, crémaster est stimulée par injection de intrascrotale IL1β, CCL2, TNFß ou fMLP. Après 2-4 heures, les tissus sont ensuite chirurgicalement extériorisés et analysés par microscopie confocale intravitale 9-11.Le protocole suivant décrit un procédé pour surveiller les monocytes et neutrophiles dans le même temps à toutefluorescence inversé de microscope confocal. En outre, notre méthode en détail comment l'image du même navire avant (d'état d'équilibre) et après l'inflammation et comment suivre la cinétique de recrutement des leucocytes. A cet effet, nous utilisons le CX 3 CR1 souris GFP / poids, dont les monocytes expriment eGFP, iv injecté avec une orange neutrophiles murins marqués par un colorant. En utilisant un microscope confocal inversé, il est possible (1) pour suivre et analyser les patrouilles Ly6C faibles monocytes dans des conditions stables et (2) de suivre le recrutement de deux monocytes et neutrophiles dans le même navire après une inflammation locale. Ici, nous créons les conditions inflammatoires en utilisant l'agoniste TLR2 / TLR1 PAM3CSK4 12. En outre, comme l'imagerie peut aider à déterminer le rôle de molécules spécifiques d'intérêt dans les différentes étapes de la cascade de recrutement des leucocytes si elle est effectuée sur des souris knock-out spécifiques ou en présence d'anticorps bloquants 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement monocytes et le comportement des neutrophiles dans les veines mésentériques dans des conditions stables et inflammatoires.
L'étape cruciale de la préparation est l'immobilisation de l'intestin avec des tissus PBS-mouillées. Si effectué correctement, les vaisseaux mésentériques sont joliment exposés sur la lamelle pour l'acquisition d'image. Cela permet la sél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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