Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Resposta imunitária eficaz é dependente rápida mobilização de leucócitos do sangue para o local da infecção ou lesão. Investigar a migração de leucócitos in vivo é essencial para compreender a base molecular da migração transendotelial de leucócitos e a interacção com o endotélio vascular. Uma poderosa abordagem envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.
Aqui apresentamos um protocolo para monócitos de imagem e neutrófilos no CX 3 CR1 gfp / p iv rato injetado com neutrófilos marcados com corante laranja com um microscópio confocal invertido. Filmes de lapso de tempo recolhidas a partir de 30 minutos a várias horas de imagens permitem a análise do comportamento de leucócitos nas veias mesentérica em ambas as condições estaduais e inflamatórias estáveis. Nós também descrevem os passos para induzir localmente inflamação dos vasos sanguíneos com TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 e monitorar o subsequeNT recrutamento de neutrófilos e monócitos.
A técnica apresentada pode também ser utilizado para monitorizar outras populações de leucócitos e as moléculas implicadas na investigar o recrutamento de leucócitos ou o tráfico que utilizam outros estímulos ou ratinhos transgénicos.
Introduction
Os neutrófilos e os monócitos são células do sistema imune inato que continuamente circulam no sangue. Após a lesão ou infecção, os sinais inflamatórios induzir diapedese de leucócitos em tecidos danificados e infectadas, aqui iniciar uma resposta imune celular 1-3. A rapidez da mobilização de leucócitos determina o resultado positivo das respostas imunes. Estes processos intrincados contar com moléculas específicas (por exemplo, selectinas, quimiocinas vinculado do endotélio) presentes no endotélio inflamado que ajudam para o estabelecimento de contactos adesivas entre leucócitos circulantes e do endotélio 1-3 .Para obter insights sobre as moléculas implicadas na leucócitos recrutamento cascata, é importante para visualizar a cinética do recrutamento de células e para controlar o comportamento de cada célula / população. Um método eficaz envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.
conteúdo "> Até à data, várias abordagens utilizando microscopia intravital foram desenvolvidos para a imagem da vasculatura 4,5. Por exemplo, a imagem latente da derme ou veias da orelha vasculatura mesentéricos por microscopia confocal intravital foi usada para identificar o comportamento de patrulha Ly6C murino e humano monócitos baixos CD14 dim CD16 + monócitos no lado luminal dos vasos sanguíneos sob condições de estado estacionário 6-8. O modelo de vasculatura do mouse cremaster é muitas vezes usado para monitorar o comportamento dos neutrófilos ou monócitos Ly6C inflamatória elevadas em condições inflamatórias ou isquêmicas em ratinhos transgénicos. Nesse caso, cremaster é estimulada através de injecção intrascrotal de IL1β, CCL2, TNFp ou fMLP. Depois de 4/2 hora, os tecidos são então exteriorizado e analisados por microscopia confocal intravital 9-11 cirurgicamente.O protocolo seguinte descreve um método para monitorizar monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo com qualquerinvertido de fluorescência confocal. Além disso, o nosso método fornece detalhes sobre como imagem do mesmo navio antes (condição de estado estacionário) e, após a inflamação e como seguir a cinética do recrutamento de leucócitos. Para este fim, usamos o CX 3 CR1 rato gfp / peso, cujo monócitos expressam eGFP, iv injetado com uma laranja neutrófilos murino marcadas com corante. Utilizando um microscópio invertido confocal, é possível (1) para monitorizar e analisar os monócitos patrulha Ly6C baixas sob condições de estado estacionário e (2) para seguir o recrutamento de monócitos e neutrófilos no mesmo vaso, após a inflamação local. Aqui nós criamos as condições inflamatórias usando o agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Além disso, tal imagem pode ajudar a determinar o papel de moléculas específicas de interesse nos vários passos da cascata de recrutamento de leucócitos se realizada em ratinhos knock-out específicas ou na presença de anticorpos bloqueadores 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
As metodologias descritas neste manuscrito fornecer uma abordagem consistente para estudar de forma eficiente monócitos e comportamento de neutrófilos nas veias mesentérica, em condições de estado estacionário e inflamatórias.
O passo crucial da preparação é a imobilização de tecidos do intestino com PBS-humedecidos. Se realizada corretamente, vasos mesentéricos são bem expostos na lamela para aquisição de imagem. Isso permite a seleção de vários domínios de interesse par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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