Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.
Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX 3 CR1 gfp / peso iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos.
La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.
Introduction
Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular a 1-3. La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el endotelio 1-3 .Para obtener ideas sobre las moléculas implicadas en los leucocitos cascada de reclutamiento, es importante para visualizar la cinética de reclutamiento de células y para rastrear el comportamiento de cada célula / población. Un método eficaz consiste en microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.
contenido "> Hasta la fecha, varios enfoques mediante microscopía intravital se desarrollaron para la imagen de la vasculatura 4,5. Por ejemplo, se utilizó la imagen de la dermis del oído vasculatura o venas mesentéricas por microscopía confocal intravital para identificar el comportamiento de patrullaje de Ly6C murino monocitos bajos y humana CD14 dim monocitos CD16 + en el lado luminal de los vasos sanguíneos en condiciones de estado estacionario 6-8. El modelo vasculatura cremáster ratón se utiliza a menudo para monitorear el comportamiento de neutrófilos o monocitos Ly6c inflamatoria altos en condiciones inflamatorias o isquémicas en ratones transgénicos. En ese caso, cremáster se estimula a través de la inyección de intraescrotal IL1β, CCL2, TNFß o fMLP. Después de 2-4 horas, tejidos se exteriorizan y se analizaron por microscopía confocal intravital 9-11 quirúrgicamente.El siguiente protocolo describe un método para monitorear monocitos y neutrófilos, al mismo tiempo con cualquierde fluorescencia invertida microscopio confocal. Por otra parte, nuestro método detalla cómo reproducir el mismo recipiente antes (condición de estado estable) y después de la inflamación y cómo seguir la cinética de reclutamiento de leucocitos. Para este fin, se utiliza el CX 3 CR1 ratón gfp / peso, cuya monocitos expresar eGFP, iv inyectado con una naranja neutrófilos murinos marcados con colorante. El uso de un microscopio confocal invertido, es posible (1) para rastrear y analizar los monocitos bajos Ly6c patrullaje bajo condiciones de estado estacionario y (2) para seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos ambos en el mismo recipiente después de la inflamación local. Aquí creamos las condiciones inflamatorias mediante el agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Además, tal formación de imágenes puede ayudar a determinar el papel de las moléculas específicas de interés en las diversas etapas de la cascada de reclutamiento de leucocitos si se realiza en ratones knock-out específicas o en presencia de anticuerpos bloqueantes 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias.
El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
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