腹腔内卵巣癌転移の定量
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
上皮性卵巣癌（EOC）2015年に米国での推定21290新たな診断と推定14180人が死亡1で、婦人科悪性腫瘍による死亡の最も一般的な原因です。女性の大多数（> 75パーセント）が拡散腹腔内転移および予後不良によって特徴づけ後期疾患（ステージIIIまたはIV）と診断されています。ファーストライン化学療法後の腹腔内疾患再発も一般的であり、死亡率2,3の主要な原因を表します。 EOCは、単一細胞または多細胞集合体のような直接の近隣腹膜臓器への原発腫瘍からの伸長だけでなく、原発腫瘍の表面からの細胞の解離または脱落によって両方を含むユニークな機構により、転移します。彼らは剥離誘導アポトーシスレジスト4を特徴とする細胞は、腹腔内に流されています。小屋腫瘍細胞が腹膜リンパドレナージとtをブロックとして腹膜腹水の蓄積は、一般的ですumorsは血管透過性を変化させ、増殖因子を産生します。彼らは固定し、複数の広く普及二次病変3,5を生成するために増殖し、そこで小屋腫瘍細胞の一部は、腸、肝臓、大網および腸間膜を含む腹膜臓器や構造の表面に付着します。血行性転移はまれです。したがって、臨床管理は、一般的に（どんなに小）すべての可視腫瘍の切除のように定義された「最適な減量」を含む腫瘍縮小手術、で構成されていません。完全な細胞減少は、全生存期間6,7の有意な増加と関連していると識別し、病変の除去<0.5 cmという課題に関連しています。
小動物モデルは、疾患の進行の理解を改善するのにも同様に予後バイオマーカーおよび新規な化学療法又は併用療法アプローチのテストの同定卵巣癌研究における有用性が証明されています。プライマリとして卵巣癌の発生率および転移の部位が腹腔で、EOC転移の同所性モデルは、腹腔内疾患の分析および特徴づけを伴います。画像腫瘍細胞の能力における最近の改善がなされているが、単一細胞レベルで、まだEOCの転移性腫瘍量を定量化において著しい困難が存在します。これらの課題は数、サイズおよび転移性病変の解剖学的位置に起因し発生します。さらに、正常な宿主細胞と区別するために、癌細胞を標識する必要性が存在します。以前の研究では、抗体ベースの標識プロトコール又はルシフェラーゼ8,9による腫瘍細胞のトランスフェクションを利用しています。癌細胞の直接の蛍光標識は、最初に1997年10で千島および共同研究者によって報告された。蛍光標識は、外因性基質の添加を必要と絶妙な腫瘍細胞特異性を提供する、癌転移11,12を追跡するためのより効果的な手段を提供しません</suP>。
本明細書において、我々は、マウスID8卵巣癌細胞13免疫コンピテントC57 / BL6マウスに赤色蛍光タンパク質（RFP）からなる同系同所性異種移植片モデルを使用して、転移性疾患の定量分析のための光学撮像方法-タグ説明します。私たちは、組織の自家蛍光を除去しながら撮影を生体内で組み合わせ、ex vivoでの相対的腫瘍量の定量化の新規な方法を示しています。この手法は、卵巣癌の臓器特異的な転移に特異的な遺伝子、エピジェネティックなまたは微小環境の改変および/または治療法の効果を評価するために設計された研究において潜在的な有用性を有します。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫不全マウスで実施されなければならない、ヒト卵巣癌細胞を用いた研究とは対照的に、上述のプロトコルは、免疫C57 / BL6マウスおよび同系マウスの卵巣癌細胞を利用します。これは、腫瘍の進行および転移における免疫浸潤の潜在的な役割の評価を可能にしながら、腹部の表面に黒い髪の存在は、撮像感度が低いレンダリングします。撮像前に毛を除去する脱毛剤の使用は、画像取得を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. 암 연구학. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. 암 연구학. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. 암 연구학. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
