الكميات من البينية البريتوني ورم خبيث سرطان المبيض
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
سرطان المبيض الظهاري (EOC) هو السبب الأكثر شيوعا للوفاة من الخباثة خاص بأمراض النساء، مع ما يقدر بنحو 21290 حالة إصابة جديدة في الولايات المتحدة في عام 2015، ويقدر بنحو 14180 حالة وفاة 1. يتم تشخيص الغالبية العظمى (> 75٪) من النساء يعانون من مرض في وقت متأخر من المرحلة (المرحلة الثالثة أو الرابعة) تتميز منتشر في جميع أجزاء داخل البريتوني وسوء أحوال الطقس. تكرار المرض في التجويف البريتوني بعد العلاج الكيميائي الخط الأول كما هو شائع، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية لوفيات 2،3. EOC مستطير بواسطة آلية فريدة من نوعها تضم كلا من امتداد مباشر من الورم الأساسي إلى أجهزة البريتوني المجاورة فضلا عن التفكك أو سفك الخلايا من سطح الورم الرئيسي باسم خلايا مفردة أو مجاميع متعددة الخلايا. يتم تسليط الخلايا في التجويف البريتوني، حيث أنها مقاومة الناجم عن انفصال الخلايا 4. تراكم الاستسقاء البريتوني هو شائع، حيث تتصدى الخلايا السرطانية تسليط التصريف اللمفاوي البريتوني ورumors إنتاج عوامل النمو التي تغير نفاذية الأوعية الدموية. جزء من الخلايا السرطانية سقيفة نعلق على السطح من الأجهزة والهياكل البريتوني بما في ذلك الأمعاء والكبد والثرب ومساريق، وعندها ترسيخ وتتكاثر لإنتاج العديد من الآفات الثانوية نطاق واسع 3،5. ورم خبيث الدموي غير شائع. وهكذا، وإدارة السريرية يتكون عادة من عملية جراحية cytoreductive بما في ذلك "debulking الأمثل"، الذي يعرف بأنه استئصال كل الورم مرئية (مهما كانت صغيرة). ويرتبط cytoreduction كاملة مع زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة بشكل عام 6،7 ويترافق مع التحدي المتمثل في تحديد وإزالة الآفات <0.5 سم.
لقد أثبتت النماذج الحيوانية الصغيرة فائدة في البحث سرطان المبيض في تحسين فهمنا لتطور المرض، وكذلك في تحديد المؤشرات الحيوية النذير واختبار الكيميائي جديدة أو نهج الجمع بين العلاج. كما الابتدائيموقع الإصابة بسرطان المبيض وورم خبيث هو التجويف البريتوني، ونماذج مثلي من EOC ورم خبيث تنطوي على تحليل وتوصيف المرض داخل الصفاق. وإن كانت هناك تحسينات الأخيرة في القدرة على خلايا الورم صورة، حتى على مستوى خلية واحدة، لا تزال هناك صعوبات كبيرة في قياس عبء الورم النقيلي من مركز عمليات الطوارئ. تبرز هذه التحديات نظرا لعدد وحجم وموقع تشريحي من الآفات النقيلي. وعلاوة على ذلك توجد حاجة إلى الخلايا السرطانية التسمية لتمييزها عن الخلايا المضيفة العادية. وقد استخدمت الدراسات السابقة بروتوكولات وضع العلامات على الأضداد أو ترنسفكأيشن من الخلايا السرطانية مع 8،9 وسيفيراز. وذكر العلامات الفلورية المباشر للخلايا السرطانية أولا قبل Chishima وزملاء العمل في عام 1997 10. تسميات الفلورسنت لا تتطلب إضافة الركيزة الخارجية، وتوفير مجموعة رائعة خصوصية الخلايا السرطانية، وتوفير وسيلة أكثر فعالية لتعقب السرطان ورم خبيث 11،12 </suص>.
هنا نحن تصف طريقة التصوير الضوئي للتحليل الكمي من المرض المنتشر باستخدام نموذج طعم أجنبي مثلي مسانج تتألف من أحمر ببروتين (RFP) -tagged الفئران ID8 خلايا سرطان المبيض 13 و الفئران C57 / BL6 المناعية المختصة. ونحن لشرح طريقة رواية النسبي تقدير عبء الورم الجمع في الجسم الحي وخارج الحي التصوير مع إزالة الأنسجة لصناعة السيارات في مضان. هذا النهج لديه فائدة محتملة في دراسات تهدف إلى تقييم تأثير معين وراثية، أو جينية الدقيقة البيئي التعديلات و / أو طرق العلاج على الانبثاث-جهاز معين من سرطان المبيض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى النقيض من الدراسات التي تستخدم خلايا سرطان المبيض الإنسان التي يجب أن تجرى في الفئران المناعة، ووصف بروتوكول أعلاه يستخدم مناعيا الفئران C57 / BL6 وخلايا سرطان المبيض الفئران مسانج. في حين أن هذا يمكن تقييم الدور المحتمل للتتسرب المناعة في تطور الورم والانبثاث، وج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. 암 연구학. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. 암 연구학. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. 암 연구학. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
