Kvantificering af Intra-peritoneal Kræft i æggestokkene Metastase
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
Epiteliale ovariecancer (EOC) er den mest almindelige dødsårsag fra gynækologisk malignitet, med en anslået 21,290 nye diagnoser i USA i 2015 og en anslået 14,180 dødsfald 1. Langt de fleste (> 75%) af kvinderne er diagnosticeret med sene sygdom (fase III eller IV) kendetegnet ved diffus intraperitoneal metastaser og dårlig prognose. Sygdom tilbagefald i bughulen efter første-line kemoterapi er også almindeligt, og udgør en væsentlig årsag til dødelighed 2,3. EOC metastasizes ved en unik mekanisme, der involverer både direkte forlængelse fra den primære tumor til tilstødende peritoneale organer samt ved dissociation eller udgydelse af celler fra den primære tumor overflade som enkelte celler eller flercellede aggregater. Celler kaste ind i bughulen, hvorved de modstår løsrivelse apoptose 4. Ophobning af peritoneal ascites er fælles, som kaste tumorceller blokere peritoneal lymfedrænage og tumors producerer vækstfaktorer, der ændrer vaskulær permeabilitet. En portion af stald tumorceller vedhæfte til overfladen af peritoneale organer og strukturer, herunder tarm, lever, omentum og mesenterium, hvorefter de forankres og prolifererer til at producere flere udbredte disseminerede sekundære læsioner 3,5. Hæmatogen metastaser er ualmindeligt. Således kliniske behandling almindeligvis består af cytoreduktive kirurgi herunder "optimale debulking", defineret som resektion af alle synlige tumor (uanset hvor lille). Komplet cytoreduktion er forbundet med en betydelig stigning i samlet overlevelse 6,7 og er forbundet med den udfordring, identifikation og fjernelse af læsioner <0,5 cm.
Små dyremodeller har vist anvendelighed i æggestokkene kræftforskning i at forbedre vores forståelse af sygdomsprogression samt i identifikation af prognostiske biomarkører og afprøvning af nye kemoterapi eller kombinationsterapi tilgange. Da det primæresite af ovariecancer forekomst og metastase er bughulen, ortotopisk modeller af EOC metastase bestå i en analyse og karakterisering af intraperitoneal sygdom. Selv om der har været de seneste forbedringer i evnen til billedet tumorceller, selv på enkelt celle niveau, der stadig betydelige problemer med at kvantificere metastatiske tumor byrde af EOC. Disse udfordringer opstår på grund af antallet, størrelsen og anatomiske placering af metastatiske læsioner. Endvidere er der et behov for etiket kræftceller til at skelne dem fra normale værtsceller. Tidligere undersøgelser har anvendt antistof-baserede protokoller eller transfektion af tumorceller med luciferase 8,9 mærkning. Direkte fluorescerende mærkning af cancerceller blev først rapporteret af Chishima og medarbejdere i 1997 10. Fluorescerende mærker kræver ikke tilsætning af eksogent substrat og tilvejebringe udsøgt tumorcellespecificitet, leverer et mere effektivt middel til at spore cancermetastase 11,12 </sup>.
Heri beskrives en optisk billeddannelse fremgangsmåde til kvantitativ analyse af metastatisk sygdom under anvendelse af en syngen ortotopisk xenograftmodel består af rødt fluorescerende protein (RFP) -mærket murine ID8 ovariecancerceller 13 og immunkompetente C57 / BL6-mus. Vi demonstrerer en ny fremgangsmåde til relativ tumorbyrde kvantificering kombinere in vivo og ex vivo-billeddannelse med fjernelse af væv autofluorescens. Denne tilgang kan potentielt anvendes i undersøgelser for at vurdere effekten af specifikke genetiske, epigenetiske eller mikro-miljø ændringer og / eller behandlingsmodaliteter på orgel-specifikke metastaser af kræft i æggestokkene.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modsætning til undersøgelser med humane ovarie kræftceller, der skal gennemføres i immunkompromitterede mus, beskrev protokollen ovenfor udnytter immunkompetente C57 / BL6 mus og syngene murine æggestokkene cancerceller. Mens dette muliggør vurdering af den potentielle rolle af immune infiltrater i tumorudvikling og metastase, tilstedeværelsen af mørkt hår på den abdominale overflade gør billeddannelse mindre følsomme. Anvendelse af en rigtige spørgsmål at fjerne hår før billeddannelse forbedrer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. 암 연구학. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. 암 연구학. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. 암 연구학. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
