복강 내 난소 암 전이의 정량
Summary
Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.
Abstract
Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.
Introduction
상피 난소 암 (EOC)는 2015 년 미국에서 추정 된 21,290 새로운 진단 및 약 14,180 사망자 1 부인과 악성 종양으로 인한 사망의 가장 흔한 원인이다. 여성의 대부분 (> 75 %) 말기 질환으로 진단 (단계 III 또는 IV) 확산 – 내 복막 전이와 예후을 특징으로한다. 첫 번째 라인 화학 요법 다음 복강 질병의 재발은 일반적이며 사망률 2,3의 주요 원인을 나타냅니다. EOC는 직접 이웃 복막 기관에 기본 종양에서뿐만 아니라 해리로 확장 또는 단일 세포 또는 다세포 집계로 기본 종양 표면에서 세포의 발산을 모두 포함하는 독특한 메커니즘에 의해 전이를. 그들은 분리 – 유도 아폽토시스 4 레지스트 상기 세포를 복강 내로 흘려된다. 창고 종양 세포가 복막 림프 배수와 t을 차단으로 복막 복수의 축적은, 일반적이다umors는 혈관 투과성을 변경 성장 인자 생산. 이들은 앵커 복수 널리 보급 보조 병변 3,5- 생산 증식 그러자 흘렸다 종양 세포의 일부는, 소장, 간, 복막 및 장간막 포함한 복막 기관 및 구조물의 표면에 부착. 혈행 성 전이는 드물다. 따라서, 임상 관리는 일반적으로 (아무리 작은) 모든 눈에 보이는 종양의 절제로 정의 "최적의 용적 축소"를 포함하는 종양 감축 수술, 구성하지 않습니다. 전체 cytoreduction 전반적인 생존 -6,7- 상당한 증가와 연관된 식별 병변 제거 <0.5 cm의 과제와 관련된다.
작은 동물 모델은 예후 바이오 마커 및 신규 화학 요법 또는 병용 요법 방식의 테스트의 식별에서뿐만 아니라 질병의 진행에 대한 우리의 이해를 개선 난소 암 연구의 유틸리티를 입증했다. 기본으로난소 암 발생과 전이의 사이트는 복강가, EOC 전이의 동 소성 모델은 복강 질환의 분석 및 특성을 포함한다. 화상 종양 세포의 능력이 최근 개선되었지만, 심지어 단일 세포 수준에서 여전히 EOC의 전이성 종양 부담을 정량화에 상당한 어려움이 존재한다. 이러한 문제로 인해 수, 크기 및 전이성 병변의 해부학 적 위치로 발생한다. 또한, 정상 숙주 세포를 구별하는 라벨 암세포에 대한 필요성이 존재한다. 이전의 연구는 항체 기반 프로토콜 라벨 또는 루시페라아제 8,9 종양 세포의 형질 전환을 이용했다. 암세포를 직접 형광 표식은 제 1997 10 Chishima 동료에 의해보고되었다. 형광 라벨 암전 (11, 12)를 추적하기 위해 외인성 기질의 첨가를 필요로 정교한 종양 세포 특이성을 제공하는 더 효율적인 수단을 제공하지 않는다 </suP>.
여기서 우리는 뮤린 ID8 난소 암 세포 (13)와 면역 능력 C57 / BL6 마우스를 적색 형광 단백질 (RFP)로 이루어지는 동계 동 소성 이종 이식 모델을 사용 전이성 질환의 정량 분석 용 광학 이미징 방법 -tagged 설명한다. 우리는 상대 종양 부담 정량화하는 새로운 방법은 조직의 자동 형광의 제거로 생체 내 및 생체 이미징의 결합을 보여줍니다. 이 접근법은 난소 암 기관 특이 전이 특정 유전자, 성적인 또는 미세 환경 변형 및 / 또는 치료 방법의 효과를 평가하기위한 연구에 활용 가능성이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역 된 마우스에서 수행되어야 인간 난소 암 세포를 사용하는 연구와 대조적으로,이 프로토콜은 상술 한 면역 C57 / BL6 마우스와 뮤린 동계 난소 암 세포를 이용한다. 이 종양 진행 및 전이 면역 침윤의 잠재적 역할에 대한 평가를 가능하게하지만, 복부의 표면에 검은 머리카락의 존재는 이미징 덜 민감 렌더링한다. 탈모의 사용은 촬상 전에 모발 화상 취득 향상을 제거하지만, 시간 소모적 특히 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
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