Kvantifisering av Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastase

Summary

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Abstract

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Introduction

Ovarialcancer (EOC) er den vanligste dødsårsaken fra gynecologic malignitet, med anslagsvis 21,290 nye diagnoser i USA i 2015 og anslagsvis 14,180 dødsfall ^1. De aller fleste (> 75%) av kvinner diagnostisert med sent stadium sykdommen (stadium III eller IV) preget av diffuse intra-peritoneal metastasering og dårlig prognose. Tilbakefall av sykdommen i bukhulen etter førstelinje kjemoterapi er også vanlig, og representerer en viktig årsak til dødelighet ^2,3. EOC metastasizes ved en unik mekanisme som involverer både direkte forlengelse fra den primære tumor til nabo peritoneal-organer samt ved dissosiasjon eller shedding av celler fra den primære tumor overflate som enkeltceller eller multi-cellulære aggregater. Celler blir skur inn i bukhulen, karakterisert ved at de motstår løsgjøring-indusert apoptose ^4. Oppbygging av peritoneal ascites er vanlig, som kaster kreftceller blokkere peritoneal lymfedrenasje og tumors produsere vekstfaktorer som endrer vaskulær permeabilitet. En del av skur tumorceller feste seg til overflaten av peritoneale organer og strukturer, inkludert tarm, lever, omentum og mesenteriet, hvoretter de anker og proliferere for å produsere flere vidt spredte sekundære lesjoner ^3,5. Hematogenous metastase er uvanlig. Dermed klinisk ledelse består vanligvis av cytoreduserende kirurgi inkludert "optimal debulking", definert som reseksjon av all synlig tumor (uansett hvor lite). Fullstendig cytoreduksjon er assosiert med en signifikant økning i total overlevelse ^6,7 og er forbundet med utfordringen med identifikasjon og fjerning av lesjoner <0,5 cm.

Små dyremodeller har vist nytte i eggstokkreft forskning i å forbedre vår forståelse av sykdomsutvikling samt legitimasjon av prognostiske biomarkører og testing av nye kjemoterapi eller kombinasjonsbehandling tilnærminger. Som primærside eggstokkreft forekomst og metastase er bukhulen, ortotopiske modeller av EOC metastasering involverer analyse og karakterisering av intraperitoneal sykdom. Selv om det har vært de siste forbedringer i evnen til bilde kreftceller, selv på celle-nivå, det finnes fortsatt betydelige vanskeligheter i å kvantifisere metastatisk svulst byrden av EOC. Disse utfordringene oppstår på grunn av antall, størrelse og anatomisk plassering av metastatiske lesjoner. Videre foreligger det et behov for å merke kreftceller til å skille dem fra normale vertsceller. Tidligere studier har benyttet antistoffbaserte merkingsprotokoller eller transfeksjon av tumorceller med luciferase ^8,9. Direkte fluorescerende merking av kreftceller ble først rapportert av Chishima og medarbeidere i 1997 ^10. Fluorescerende markører krever ikke tilsetning av eksogent substrat og gi utsøkt tumorcelle spesifisitet, noe som gir et mer effektivt middel for å spore kreft metastase ^11,12 </sup>.

Heri vi beskriver en optisk avbildningsmetode for kvantitativ analyse av metastatisk sykdom ved hjelp av en syngene orthotopic xenograft modell består av rød fluorescerende protein (RFP) -tagged murine ID8 eggstokkreft celler ¹³ og immunkompetente C57 / BL6 mus. Vi viser en ny fremgangsmåte for relativ tumorbyrden kvantifisering kombinere in vivo og ex vivo avbildning med fjerning av vev auto-fluorescens. Denne tilnærmingen har potensial verktøy i studier designet for å evaluere effekten av spesifikke genetiske, epigenetiske eller mikro-miljø modifikasjoner og / eller behandlingsmetoder på organspesifikk metastasering av eggstokkreft.

Protocol

Alle in vivo studier ble godkjent av University of Notre Dame Animal Care og bruk komité og brukt kvinnelige C57 / BL6J mus. 1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture Gjør ID8 murine eggstokkreft cellekulturmedium som følger: 1 liter av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 4% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 5 ug / ml insulin, 5 ug / ml Transferrin og 5 ng / ml natriumselenitt. Transduce ID8 murine eggstokkreft celler <s…

Representative Results

Den metastatisk mekanisme for eggstokkreft er preget av svært diffuse intra-peritoneal metastase består av mange lesjoner av varierende størrelse, inkludert flere små (<2mm) lesjoner. Således bruk av RFP-merkede tumorceller (figur 1) og optisk imaging tilveiebringer en alternativ metode til manuell telling og måling av lesjon størrelse. Utviklingen av tumorbyrden over tid kan bli bestemt ved ukentlig veiing av mus og måling av abdominal omkrets for å måle po…

Discussion

I motsetning til studier med humane eggstokkreft celler som må gjennomføres i immunsupprimerte mus, beskrevet protokollen ovenfor benytter immunkompetente C57 / BL6 mus og syngene murine eggstokkreft celler. Selv om dette muliggjør vurdering av den potensielle rolle av immun infiltrater i tumorprogresjon og metastase, tilstedeværelse av mørkt hår på bukhinnen gjengir bilde mindre følsom. Bruk av en hårfjerningskrem for å fjerne hår før bildebehandling forbedrer bildeoverføring, men er tidkrevende, spesielt …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910