Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune complexe caractérisé prototypiquement par l'anticorps anti-nucléaire (ANA) et de la production glomérulonéphrite. De nombreux autres séquelles, y compris dermique, cardio-pulmonaire, et des lésions hépatiques sont associés à la maladie chez certains individus. Les estimations de prévalence aux États-Unis varient considérablement, de ^1,2 150,000-1,500,000, avec incidence particulièrement élevée chez les femmes et les minorités ^3. Bien que l'étiologie de la SLE a été difficile à discerner, il est pensé pour résulter de l'interaction de divers facteurs génétiques et environnementaux, qui culminent dans l'auto-immunité systémique.

De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour étudier les facteurs menant à l'apparition et la progression de la maladie. Des modèles de souris classiques de SLE comprennent des souches de souris génétiquement prédisposées, y compris le modèle NZB x NZW F1 et ses dérivés NZM, la souche / lpr MLR, et la souche BXSB / Yaa et systèmes inductibles, tels que le pristane et la maladie chronique du greffon contre l'hôte (cGVHD) ⁴ modèles. Les premiers rapports de la production d'auto-anticorps dans des modèles de GVHD utilisés souches de souris différentes souches ou de hamster pour parent dans les transferts de F1 ^{5 – 8;} méthodes les plus courantes utilisées pour étudier la maladie lupique comprennent actuellement les DBA / 2 → parent (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, et le modèle de transfert de bm12 décrit ici. Chaque modèle a ses propres mises en garde, mais ils partagent en général un ensemble commun de caractéristiques qui sont en corrélation avec des caractéristiques cliniques de la maladie humaine. Les paramètres les plus souvent rapportés chez les souris modèles comprennent une splénomégalie, lymphadénopathie, la néphrite, la production ANA, et au niveau cellulaire, l'expansion des cellules T folliculaires auxiliaires (TFH), germinales cellules centre (GC) de B et les cellules plasmatiques.

Le modèle BM12 inductible est réalisé par le transfert adoptif de lymphocytes à partir de IA ^BM12 B6 (C) – H2 – Ab1 ^BM12 / KhEgJ (BM12) chez la souris, une souche identical de souris C57BL / 6 à l'exception de 3 substitutions d'acides aminés sur le CMH de classe II, en IA ^{b /} 6 (B6) des souris C57BL. Alloactivation des donateurs cellules T CD4 par bénéficiaire APC conduit à cGVHD avec des symptômes ressemblant étroitement SLE. Plus précisément, ils comprennent l'expansion de Tfh donateurs dérivés, l'expansion des cellules B GC bénéficiaires dérivés et les cellules plasmatiques, et la production d'Anas y compris les anti-ADN double brin, anti-ADNsb, anti-chromatine, et des anticorps anti-RBC ^9. Au fil du temps, les souris receveuses développent glomérulonéphrite associée à des dépôts d'IgG dans le glomérulaire, interstitielle, et les régions vasculaires des reins ^10. Nous avons récemment montré que, comme dans la maladie humaine, il y a également un rôle critique pour les IFN de type I dans ¹¹ ce modèle. Notamment, les critères de définition des SLE humaine incluent le développement de la néphrite compatible avec SLE en présence d'anticorps anti-ADN anticorps ^12, qui sont tous deux traits saillants de ce modèle de souris.

Il n'y a en soisieurs avantages du modèle de bm12 sur les modèles spontanés. Modèles classiques qui développent des signes SLE spontanément reposent sur soit des souches de souris hybrides, des souches de souris consanguines pas sur le fond de B6, ou grande loci génétiques sur le fond de B6, qui font traversant au coup de grâce ou de souris autrement génétiquement modifié difficile et fastidieux. Avec le modèle inductible de bm12, des souris génétiquement modifiées peuvent servir soit donneur ou du receveur, qui permet une identification plus rapide du compartiment cellulaire dans lequel des gènes particuliers peuvent être importants pour la maladie. En outre, le développement de la maladie dans le modèle de bm12 est beaucoup plus rapide, ne nécessitant que deux semaines jusqu'à l'apparition d'Anas, contre plusieurs mois pour les modèles les plus spontanées. En outre, à la différence des modèles spontanés qui développent la maladie à différents points dans le temps, le début et la progression de la maladie dans le modèle d'→ B6 BM12 est fortement synchronisés. Cela permet la génération de cohortes de taille appropriée qui peut Be utilisé pour les stratégies d'intervention ou thérapeutiques à tout stade de développement de la maladie.

Ce qui suit est un protocole détaillé pour initier SLE auto-immunité par le transfert adoptif de lymphocytes BM12 dans souris C57BL / 6, ou des variantes génétiques sur le fond de B6. En outre, nous décrivons un protocole de coloration par cytométrie de flux pour dénombrer Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et les types de cellules associées à la maladie humaine. Fait important, ces protocoles peuvent également être utilisés pour caractériser la plupart des maladies dans les modèles murins de lupus et identifier Tfh, les cellules B GC et les cellules plasmatiques dans d'autres modèles de maladie.

Protocol

Travaux d'animaux a été réalisée dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices établies par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International et notre institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC). NOTE: Incorporer des souris exprimant un marqueur congéniques CD45.1 tels que le donateur ou animaux receveurs si possible, car cela …

Representative Results

Souris malades développent une splénomégalie en aussi peu que 14 jours, présentant les rates 2-3 fois la taille de souris saines en termes de masse et de la cellularité (Figure 2). Les splénocytes sont séquentiellement débloqué diffusion de la lumière (FSC-A par SSC-A), l'élimination des doublets (FSC-W ou -H par le FSC-A), les cellules viables (faible coloration de la viabilité colorant) et CD4 + TCRβ + (Figure 3A). Le…

Discussion

Le modèle inductible de BM12 est un moyen relativement simple et efficace pour étudier les processus cellulaires et moléculaires de SLE. L'activation chronique des cellules T CD4 par transfert adoptif dirigés contre les antigènes du soi conduit à l'accumulation de Tfh, GC cellules B, les cellules plasmatiques et qui peut être mesurée par cytométrie en flux, comme décrit ici. Les futures études utilisant ce modèle peut rapidement et facilement interroger le rôle des gènes candidats et de nouvelles t…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017