ومحرض نموذج bm12 من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) في C57BL / 6 الفئران
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هو مرض مناعي ذاتي معقدة تتميز prototypically بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة النووي (ANA) إنتاج والتهاب كبيبات الكلى. العديد من عقابيل الآخرين، بما في ذلك الجلد، القلب والرئتين، وآفات الكبد ترتبط مع المرض في بعض الأفراد. تقديرات الانتشار في الولايات المتحدة تختلف على نطاق واسع، من 150،000-1،500،000 1،2، مع ارتفاع معدل لا سيما في النساء والأقليات 3. على الرغم من أن مسببات مرض الذئبة الحمراء وكان من الصعب تمييز، ويعتقد أن تنشأ من التفاعل بين العوامل الوراثية والبيئية المختلفة، والتي تبلغ ذروتها في المناعة الذاتية النظامية.
وقد استخدمت نماذج حيوانية عديدة لدراسة العوامل التي تؤدي إلى ظهور المرض وتطور. نماذج الماوس كلاسيكية من SLE تشمل سلالات الفئران وراثيا بما في ذلك NZB X NZW F1 نموذج ومشتقاتها NZM لها، وMLR سلالة / لبر، وسلالة BXSB / الياء، وأنظمة محرض، مثل صristane والأمراض المزمنة الكسب غير المشروع ضد المضيف (cGVHD) نماذج 4. التقارير الأولية للإنتاج الأجسام المضادة في نماذج GVHD تستخدم سلالات الفئران مختلفة أو سلالات الهامستر لالأم إلى نقل F1 5-8. أكثر الأساليب شيوعا لدراسة أمراض مثل مرض الذئبة تشمل حاليا الوالد DBA / 2 → (C57BL / 6 × DBA / 2) F1، ونموذج نقل bm12 هو موضح هنا. يحتوي كل نموذج على المحاذير الخاصة بها، لكنها تشترك عموما مجموعة مشتركة من الميزات التي ترتبط بمظاهر سريرية من الأمراض التي تصيب البشر. وتشمل المعلمات في معظم الأحيان ورد في نماذج الماوس تضخم الطحال، تضخم العقد اللمفية، التهاب الكلية، وإنتاج ANA، وعلى المستوى الخلوي، والتوسع في الخلايا التائية المساعد الجريبي (مرفأ تونس المالي)، ومركز (GC) خلايا B جرثومي، وخلايا البلازما.
ويتحقق هذا النموذج bm12 محرض من قبل نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية من IA bm12 B6 (C) – H2 – AB1 bm12 / KhEgJ (bm12) الفئران، سلالة طdentical إلى C57BL / 6 فيما عدا 3 بدائل الأحماض الأمينية على الطبقة MHC II، إلى IA ب C57BL / 6 (B6) الفئران. Alloactivation من الجهات المانحة CD4 T خلايا من قبل المرسل إليه ناقلات الجنود المدرعة يؤدي إلى cGVHD مع بأعراض مشابهة لأعراض مرض الذئبة الحمراء. على وجه التحديد، وتشمل هذه توسيع مرفأ تونس المالي المستمدة من الجهات المانحة، والتوسع في GC خلايا B-المستمدة المستفيدة وخلايا البلازما، وإنتاج أنس بما في ذلك مكافحة لمكافحة dsDNA، ومكافحة ssDNA، ومكافحة الكروماتين، وأضداد RBC 9. مع مرور الوقت، الفئران المتلقي تطوير التهاب كبيبات الكلى المرتبطة الودائع مفتش في الكبيبي، فراغي، والمناطق الأوعية الدموية في الكلى 10. نحن في الآونة الأخيرة أنه، على غرار الأمراض التي تصيب البشر، وهناك أيضا دورا حاسما في النوع الأول الإنترفيرون في هذا النموذج 11. وتجدر الإشارة إلى المعايير المحددة لSLE البشري تشمل تطوير التهاب الكلية متوافق مع SLE بحضور المضادة لمكافحة dsDNA الأجسام المضادة 12، وكلاهما من السمات البارزة لهذا النموذج الماوس.
هناك حد ذاتهامزايا veral من طراز bm12 على نماذج عفوية. النماذج الكلاسيكية التي تنمي SLE تشبه علامات تلقائيا تعتمد على أي سلالات الفئران الهجينة، والسلالات الفطرية الماوس لا على خلفية B6، أو المواضع الجينية كبير على خلفية B6، والتي تجعل العبور إلى بالضربة القاضية أو الفئران المعدلة وراثيا إلا صعبة وتستغرق وقتا طويلا. مع نموذج محرض bm12، يمكن أن الفئران المعدلة وراثيا بمثابة إما الجهة المانحة أو المستفيدة، مما يتيح مزيدا من التحديد السريع للمقصورة الخلوية التي جينات معينة قد تكون مهمة لمرض. وعلاوة على ذلك، تطور المرض في نموذج bm12 هي أسرع بكثير، وتتطلب فقط 2 أسابيع حتى ظهور أنس، مقارنة عدة أشهر لنماذج أكثر عفوية. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من نماذج العفوية التي تطور المرض عند نقاط زمنية مختلفة، وتزامن غاية بداية المرض والتقدم في نموذج B6 bm12 →. وهذا يسمح للجيل الأفواج بحجم مناسب يمكن أن بالبريد تستخدم لاستراتيجيات التداخلية العلاجية أو في أي مرحلة من مراحل تطور المرض.
ما يلي هو بروتوكول مفصل لبدء مثل SLE المناعة الذاتية عن طريق نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية bm12 إلى C57BL / 6 الفئران، أو المتغيرات الجينية على خلفية B6. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف البروتوكول تلطيخ تدفق cytometric تعداد مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B، وأنواع خلايا البلازما خلايا ترتبط مع الأمراض التي تصيب البشر. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تكون هذه البروتوكولات المستخدمة لوصف المرض في معظم نماذج الماوس من مرض الذئبة الحمراء وتحديد مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B وخلايا البلازما في نماذج الأمراض الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج محرض bm12 هو وسيلة سهلة وفعالة نسبيا لدراسة العمليات الخلوية والجزيئية لSLE. تفعيل مزمن في نقل adoptively خلايا CD4 T الموجهة ضد مستضدات الذات يؤدي إلى تراكم مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B، وخلايا البلازما التي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي، كما هو موضح هنا. الدراسات ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
References
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
- Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -. Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
- Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
- Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
- Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
- Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
- Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
- Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
- Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
- Petri, M., Orbai, A. -. M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- . Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012)
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , (2009).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
- Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
- Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
- McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y.. Nature. 376, 695-698 (1995).
- Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
- Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
- Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
- Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
