The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en kompleks autoimmun sygdom karakteriseret forbilledet af anti-nukleare antistof (ANA) produktion og glomerulonephritis. Talrige andre følgetilstande, herunder dermal, hjerte-lunge og leverlæsioner er forbundet med sygdom hos nogle personer. Skøn over udbredelsen i USA varierer meget, fra 150,000-1,500,000 1,2, med særlig høj forekomst hos kvinder og minoriteter 3. Selvom ætiologien af SLE har været vanskeligt at få øje på, menes det at opstå fra samspillet mellem forskellige genetiske og miljømæssige faktorer, som kulminerer i systemisk autoimmunitet.
Talrige dyremodeller har været ansat til at studere faktorer, der fører til sygdomsdebut og progression. Klassiske musemodeller for SLE omfatter genetisk disponerede musestammer herunder NZB x NZW F1 modellen og dens NZM derivater, MLR / lpr-stamme, og BXSB / Yaa stamme og inducerbare systemer, såsom pristane og kronisk graft-versus-host-sygdom (cGVHD) modeller 4. Tidlige rapporter om autoantistofproduktion i GVHD modeller anvendt forskellige musestammer eller hamster stammer til forældre i F1 overførsler 5 – 8; mere almindelige metoder, der anvendes til at studere lupus-lignende sygdom omfatter i øjeblikket DBA / 2 forælder → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, og bm12 overføringsmodel beskrevet her. Hver model har sine egne forbehold, men de generelt deler et fælles sæt af funktioner, der korrelerer med de kliniske funktioner i human sygdom. De oftest rapporterede parametre i musemodeller omfatter splenomegali, lymfadenopati, nephritis, ANA produktion og på celleniveau, udvidelse af T follikulære hjælperceller (TFH), kimcenter (GC) B-celler og plasmaceller.
Den inducerbare bm12 model opnås ved adoptiv overføring af lymfocytter fra IA bm12 B6 (C) – H2 – Ab1 bm12 / KhEgJ (bm12) mus, en stamme identical til C57BL / 6 undtagen 3 aminosyresubstitutioner på MHC klasse II, i IA b C57BL / 6 (B6) -mus. Alloaktivering af donor CD4 T-celler ved modtagerens APC'er fører til cGVHD med symptomer ligner SLE. Specifikt omfatter disse udvidelse af donorafledte TFH, udvidelse af modtagerens-afledte GC B-celler og plasmaceller, og produktion af Anas herunder anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-chromatin og anti-RBC-antistoffer 9. Over tid, recipientmus udvikle glomerulonephritis i forbindelse med IgG indskud i den glomerulære, interstitiel, og vaskulære områder i nyrerne 10. Vi har for nylig vist, at i lighed med human sygdom, er der også en kritisk rolle for type I IFN i denne model 11. Især de definerer kriterier for human SLE omfatter udvikling af nephritis kompatibel med SLE i nærvær af anti-dsDNA-antistoffer 12, som begge er fremtrædende træk ved denne musemodel.
Der er seVeral fordele ved bm12 model over de spontane modeller. Klassiske modeller, der udvikler SLE-lignende tegn spontant afhængige af enten hybride musestammer, indavlede musestammer ikke på B6 baggrund, eller store genetiske loci på B6 baggrund, som gør passerer til knockout eller på anden måde genetisk modificerede mus vanskeligt og tidskrævende. Med bm12 inducerbare model, kan genetisk modificerede mus tjene som enten donor eller modtager, mulighed for en hurtigere identifikation af det cellulære rum, hvor bestemte gener kan være vigtige for sygdommen. Desuden udvikling sygdom i bm12 model er meget hurtigere, kræver kun 2 uger, indtil fremkomsten af Anas, i forhold til flere måneder for de fleste spontane modeller. Endvidere i modsætning til de spontane modeller, der udvikler sygdommen på forskellige tidspunkter, sygdommens indtræden og progression i bm12 → B6 model er stærkt synkroniseret. Dette muliggør generering af passende størrelse kohorter, der kan Be bruges til interventionelle eller terapeutiske strategier på ethvert stadium af udviklingen sygdom.
Hvad der følger er en detaljeret protokol for at indlede SLE-lignende autoimmunitet ved adoptiv overførsel af bm12 lymfocytter i C57BL / 6 mus, eller genetiske varianter på B6 baggrund. Derudover beskriver vi en flowcytometrisk farvningsprotokollen for optælle TFH, GC B-celler og plasmaceller-celletyper forbundet med human sygdom. Det er vigtigt, kan disse protokoller også anvendes til at karakterisere sygdommen i de fleste musemodeller for SLE og identificere TFH, GC B-celler og plasmaceller i andre sygdomsmodeller.
Den bm12 inducerbar model er en forholdsvis let og effektiv måde at studere cellulære og molekylære processer i SLE. Kronisk aktivering af adoptivt overført CD4 T-celler rettet mod selv-antigener fører til akkumulering af TFH, GC B-celler og plasmaceller, som kan måles ved flowcytometri som beskrevet her. Fremtidige studier under anvendelse af denne model kan hurtigt og nemt interrogere rolle kandidatgener og nye terapier i autoimmune kimcenter processer, der ligner dem, der forekommer hos patienter med SLE, og i …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |