דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
זאבת אדמנתית מערכתית (לופוס) היא מחלה אוטואימונית מורכבת המאופיינת prototypically על ידי נוגדן אנטי-גרעיני ייצור (ANA) וגלומרולונפריטיס. סיבוכים רבים אחרים, כוללים עורי, לב-ריאה, ונגעים בכבד קשורים למחלה אצל אנשים מסוימים. הערכות שכיחות בארה"ב משתנות במידה רבה, מ150,000-1,500,000 1,2, עם שכיחות גבוהה במיוחד בנשים ומיעוטים 3. למרות אטיולוגיה של SLE כבר קשה להבחין, הוא חשב שינבע ממשחק הגומלין של גורמים גנטיים וסביבתיים שונים, שיגיעו לשיאו באוטואימוניות המערכתית.
מודלים של בעלי חיים רבים כבר מועסקים ללמוד גורמים מובילים להופעת מחלה והתקדמות. מודלים עכבר קלאסיים של SLE כוללים זני נטייה גנטית עכבר כוללים NZB x מודל NZW F1 ונגזרי NZM, המתח / LPR הקה"ע, ומתח BXSB / Yaa, ומערכות מושרה, כגון pristane ודגמי מחלת שתל נגד המארח כרוני (cGVHD) 4. דיווחים מוקדמים של ייצור נוגדנים בדגמי GVHD משמשים זנים שונים עכבר או זני אוגר להורה להעברות F1 5 – 8; שיטות נפוצות יותר בשימוש ללמוד מחלה כמו זאבת-כיום כוללות הורה DBA / 2 → (DBA / 2 x C57BL / 6) F1, ומודל העברת bm12 המתואר כאן. לכל אחד יש מודל האזהרות שלה, אבל הם בדרך כלל לשתף מערך משותף של תכונות המתואמים עם מאפיינים קליניים של מחלה אנושית. הפרמטרים לרוב דיווחו במודלים של עכברים כוללים splenomegaly, בלוטות הלימפה, דלקת כליות, ייצור ANA, וברמה התאית, ההתרחבות של תאי T זקיקי עוזר (TFH), תאי B נבטי מרכז (GC), ותאי פלזמה.
מודל bm12 מושרה מושגת על ידי העברת המאמצת של לימפוציטים מIA bm12 B6 (C) – H2 – עכברים (bm12) AB1 bm12 / KhEgJ, מתח אניdentical לC57BL / 6 למעט 3 החלפות חומצת אמינו בכיתת MHC II, לIA ב C57BL / 6 עכברים (B6). Alloactivation של תורם CD4 T תאים על ידי נמען נגמ"שים מוביל לcGVHD עם תסמינים דומים SLE מקרוב. באופן ספציפי, אלה כוללים הרחבת TFH תורם נגזרות, התרחבות של תאי שמקורם נמען GC B ותאי פלזמה, וייצור של אנאס כולל אנטי-dsDNA, אנטי-ssDNA, אנטי-הכרומטין, ונוגדנים נגד RBC 9. לאורך זמן, עכברי נמען לפתח גלומרולונפריטיס הקשורים פיקדונות IgG בגלומרולרי, ביניים, ואזורים של כלי דם של הכליות 10. הראינו לאחרונה כי, בדומה למחלות של בני אדם, יש גם תפקיד קריטי עבור סוג אני IFN במודל זה 11. יש לציין, הקריטריונים המגדירים עבור SLE האנושי כוללים את הפיתוח של דלקת כליות תואמות עם SLE בנוכחות נוגדנים נגד dsDNA 12, שניהם מאפיינים בולטים של מודל עכבר זה.
יש seיתרונות veral של מודל bm12 על המודלים ספונטניים. מודלים קלאסיים שלפתח סימנים כמו SLE-ספונטני להסתמך על שני זנים היברידיים עכבר, זנים טהורים עכבר לא על רקע B6, או לוקוסים גנטיים גדולים על רקע B6, שהופכים את מעבר לפצצה או עכברים מהונדסים גנטי אחר קשה זמן רב. עם המודל מושרה bm12, עכברים מהונדסים גנטי יכולים לשמש גם תורם או נמען, המאפשרים זיהוי מהיר יותר של התא הסלולרי שבגנים מסוימים עשויים להיות חשובים למחלה. יתר על כן, התפתחות מחלה במודל bm12 היא הרבה יותר מהר, הדורש רק 2 שבועות עד להופעת אנאס, בהשוואה למספר חודשים לדגמים ספונטניים ביותר. יתר על כן, בניגוד לדגמים ספונטניים שמתפתחים מחלה בנקודות זמן שונה, תחילת המחלה וההתקדמות במודל B6 → bm12 מסונכרנת מאוד. זה מאפשר לדור של קבוצות בגודל המתאימה שיכולות בהדואר משמש לאסטרטגיות התערבותית או טיפוליות בכל שלב של התפתחות מחלה.
להלן פרוטוקול מפורט לייזום אוטואימוניות כמו SLE-ידי העברת המאמצת של לימפוציטים bm12 לעכברי C57BL / 6, או וריאנטים גנטיים על רקע B6. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקול מכתים הזרימה cytometric לספירת TFH, GC תאי B, וסוגי תאי פלזמה תאים הקשורים למחלות אנושיות. חשוב לציין, יכולים לשמש גם פרוטוקולים אלה לאפיין מחלה ברוב דגמי עכבר של SLE ולזהות TFH, GC תאי B ותאי פלזמה בדגמי מחלה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל מושרה bm12 הוא דרך קלה יחסית ויעילה ללמוד את התהליכים התאיים ומולקולריים של SLE. הפעלה כרונית של תאי CD4 T הועברו adoptively המכוון נגד אנטיגנים עצמיים מובילה להצטברות של TFH, GC תאי B, ותאי פלזמה אשר ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה, כפי שתואר כאן. מחקרים עתידיים באמצעות מודל זה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
References
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
- Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -. Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
- Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
- Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
- Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
- Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
- Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
- Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
- Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
- Petri, M., Orbai, A. -. M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- . Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012)
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , (2009).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
- Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
- Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
- McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y.. Nature. 376, 695-698 (1995).
- Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
- Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
- Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
- Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
