C57BL / 6 चूहों में प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष की bm12 inducible मॉडल (एसएलई)

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष (एसएलई) परमाणु विरोधी एंटीबॉडी (एएनए) के उत्पादन और स्तवकवृक्कशोथ द्वारा prototypically विशेषता एक जटिल ऑटोइम्यून रोग है। कई अन्य त्वचीय सहित sequelae, कार्डियो-फेफड़े, यकृत और घावों कुछ व्यक्तियों में रोग के साथ जुड़े रहे हैं। अमेरिका में व्यापकता का अनुमान महिलाओं और अल्पसंख्यकों ³ में विशेष रूप से उच्च घटना के साथ, 150,000-1,500,000 ^1,2 से व्यापक रूप से भिन्न। एसएलई के एटियलजि विचार करने के लिए मुश्किल हो गया है, यद्यपि यह प्रणालीगत औतोइम्मुिनित में culminate जो विभिन्न आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों की परस्पर क्रिया से पैदा करने के लिए सोचा है।

कई पशु मॉडल रोग की शुरुआत और प्रगति के लिए अग्रणी कारकों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। एसएलई की क्लासिक माउस मॉडल ऐसे पी के रूप में NZW F1 मॉडल और उसके NZM डेरिवेटिव, एमएलआर / LPR तनाव, और BXSB / Yaa तनाव, और inducible सिस्टम निजामाबाद एक्स सहित आनुवंशिक रूप से संवेदनशील माउस उपभेदों शामिलristane और पुरानी भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (cGVHD) मॉडल ^4। GVHD मॉडल में स्वप्रतिपिण्ड उत्पादन की प्रारंभिक रिपोर्ट एफ 1 स्थानान्तरण ⁵ में माता पिता के लिए विभिन्न माउस उपभेदों या हम्सटर उपभेदों इस्तेमाल किया ^{– 8;} एक प्रकार का वृक्ष की तरह इस रोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया और अधिक आम तरीकों वर्तमान में डीबीए / 2 माता पिता → (C57BL / 6 एक्स डी बी / 2) एफ 1, और यहाँ वर्णित bm12 हस्तांतरण मॉडल शामिल हैं। प्रत्येक मॉडल अपने आप ही निरंतर है, लेकिन वे आम तौर पर मानव रोग के नैदानिक ​​सुविधाओं के साथ संबंध स्थापित कि सुविधाओं की एक आम सेट का हिस्सा है। माउस मॉडल में सबसे अधिक बार सूचना दी मापदंडों, तिल्ली का बढ़ना lymphadenopathy, नेफ्रैटिस, एना उत्पादन में शामिल हैं, और सेलुलर स्तर पर, टी कूपिक सहायक कोशिकाओं (Tfh), कीटाणु केंद्र (जीसी) बी कोशिकाओं, और प्लाज्मा कोशिकाओं के विस्तार।

एच 2 – – AB1 ^bm12 / KhEgJ (bm12) चूहों, एक तनाव मैं inducible bm12 मॉडल आइए ^bm12 बी -6 (सी) से लिम्फोसाइट के दत्तक हस्तांतरण द्वारा हासिल की हैMHC वर्ग द्वितीय पर 3 एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के लिए छोड़कर C57BL 6 / करने के लिए dentical, आइए में C57BL / 6 (बी -6) चूहों ^बी। प्राप्तकर्ता APCs द्वारा दाता सीडी 4 टी कोशिकाओं की Alloactivation लक्षण बारीकी एसएलई दिखने के साथ cGVHD की ओर जाता है। विशेष रूप से, इन दाता व्युत्पन्न Tfh के विस्तार, प्राप्तकर्ता व्युत्पन्न जीसी बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं के विस्तार, और विरोधी dsDNA, विरोधी ssDNA, विरोधी क्रोमेटिन, और विरोधी आरबीसी एंटीबॉडी ⁹ सहित अनस के उत्पादन में शामिल हैं। समय के साथ, प्राप्तकर्ता चूहों केशिकागुच्छीय, मध्य में आईजीजी जमा है, और गुर्दे ¹⁰ की नाड़ी क्षेत्रों के साथ जुड़े स्तवकवृक्कशोथ का विकास। हमने हाल ही में मानव रोग के लिए भी इसी तरह, मैं इस मॉडल ¹¹ में IFN प्रकार के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका है, वहाँ भी कर दिखाया है। विशेष रूप से, मानव एसएलई के लिए परिभाषित मापदंड विरोधी dsDNA की उपस्थिति में एसएलई के साथ संगत नेफ्रैटिस के विकास के इस माउस मॉडल की प्रमुख विशेषताएं हैं, जो दोनों के ¹² एंटीबॉडी शामिल हैं।

वहाँ से कर रहे हैंसहज अधिक मॉडल bm12 मॉडल की veral लाभ। अनायास एसएलई-तरह के संकेत हैं कि विकसित क्लासिक मॉडल पीटकर या अन्यथा आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों कठिन और समय लेने के लिए पार करने जो संकर माउस उपभेदों, नहीं -6 पृष्ठभूमि पर बी -6 पृष्ठभूमि, या बड़े आनुवंशिक लोकी पर जन्मजात माउस उपभेदों, या तो पर भरोसा करते हैं। Bm12 inducible मॉडल के साथ, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों विशेष जीन की बीमारी के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, जिसमें सेलुलर डिब्बे के और अधिक तेजी से पहचान की अनुमति, दाता या प्राप्तकर्ता या तो के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, bm12 मॉडल में रोग विकास सबसे सहज मॉडल के लिए कई महीनों की तुलना में, अनस की उपस्थिति तक केवल 2 सप्ताह की आवश्यकता होती है, बहुत तेजी से होता है। इसके अलावा, अलग अलग समय बिंदुओं पर रोग का विकास है कि सहज मॉडल के विपरीत, bm12 → बी -6 मॉडल में रोग की शुरुआत और प्रगति अत्यधिक सिंक्रनाइज़ है। इस ख कर सकते हैं कि उचित आकार साथियों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता हैई रोग के विकास के किसी भी स्तर पर हस्तक्षेप या चिकित्सीय रणनीतियों के लिए इस्तेमाल किया।

क्या इस प्रकार बी -6 की पृष्ठभूमि पर C57BL / 6 चूहों में bm12 लिम्फोसाइटों के दत्तक हस्तांतरण, या आनुवंशिक वेरिएंट द्वारा एसएलई-तरह औतोइम्मुिनित की शुरुआत के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। इसके अतिरिक्त, हम Tfh, जीसी बी कोशिकाओं की गणना के लिए एक प्रवाह cytometric धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन है, और प्लाज्मा कोशिकाओं सेल प्रकार मानव रोग के साथ जुड़े। महत्वपूर्ण बात है, इन प्रोटोकॉल भी एसएलई के सबसे माउस मॉडल में रोग विशेषताएँ और अन्य रोग मॉडल में Tfh, जीसी बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

पशु काम आकलन और प्रयोगशाला पशु केयर इंटरनेशनल के प्रत्यायन और हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के लिए एसोसिएशन (IACUC) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों…

Representative Results

रोगग्रस्त चूहों द्रव्यमान और कोषमयता (चित्रा 2) के मामले में spleens 2-3 बार स्वस्थ चूहों के आकार का प्रदर्शन, के रूप में छोटा रूप में 14 दिनों में तिल्ली का बढ़ना विकसित करना। Splenocytes क्रमिक रूप स?…

Discussion

bm12 inducible मॉडल एसएलई के सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान और कारगर तरीका है। स्व प्रतिजनों के खिलाफ निर्देशित adoptively का तबादला सीडी 4 टी कोशिकाओं की जीर्ण सक्रियण यहाँ वर्?…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017