O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada complexo prototipicamente pelo anticorpo anti-nuclear (ANA) produção e glomerulonefrite. Numerosas outras sequelas, incluindo dérmica, cardio-pulmonar, lesões hepáticas e estão associados com a doença em alguns indivíduos. As estimativas de prevalência em os EUA variam muito, desde 150,000-1,500,000 ^1,2, com particular incidência em alta mulheres e minorias ^3. Embora a etiologia do LES tem sido difícil de discernir, pensa-se que surgem a partir da interação de vários fatores genéticos e ambientais, que culminam na auto-imunidade sistêmica.

Inúmeros modelos animais têm sido empregados para fatores que levam ao início da doença e progressão estudar. Modelos clássicos de rato de SLE incluem estirpes de ratos geneticamente predispostos incluindo o NZB x NZW F1 modelo e os seus derivados, o NZM MLR / lpr estirpe, e a estirpe BXSB / Yaa e os sistemas indutíveis, tais como o pristane e modelos ⁴ doença crônica do enxerto-versus-hospedeiro (DECHc). Os primeiros relatórios de produção de autoanticorpos em modelos de GVHD usado várias linhagens de camundongos ou estirpes de hamster para pai em transferências F1 ^{5 – 8;} métodos mais comuns utilizados para estudar a doença de lúpus incluem atualmente o pai DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, eo modelo de transferência BM12 descrito aqui. Cada modelo tem suas próprias advertências, mas eles geralmente compartilham um conjunto comum de características que se correlacionam com características clínicas da doença humana. Os parâmetros mais frequentemente reportados em modelos de murganho incluem esplenomegalia, linfadenopatia, nefrite, produção ANA, e ao nível celular, a expansão de células T helper (foliculares TFH), ao centro (GC), as células B e células germinais, de plasma.

O modelo BM12 indutível é conseguida pela transferência adoptiva de linfócitos a partir de IA ^BM12 B6 (C) – H2 – Ab1 ^BM12 / KhEgJ (BM12) ratinhos, uma estirpe identical para murganhos C57BL / 6 com excepção de 3 substituições de aminoácidos no MHC de classe II, em ^IA b C57BL / 6 (B6) ratinhos. Aloactivação de doadores células T CD4 por destinatário APCs leva a cGVHD com sintomas muito semelhantes LES. Especificamente, estas incluem a expansão do derivado do doador TFH, a expansão das células B GC derivada do receptor e as células de plasma, e a produção de ANA incluindo anti-ADNcd e anti-ssDNA, anti-cromatina, e anticorpos anti-RBC ^9. Ao longo do tempo, ratinhos receptores desenvolver glomerulonef rite associada com depósitos de IgG no glomerular, intersticial, e regiões vasculares dos rins ^10. Mostrámos recentemente que, semelhante à doença humana, também há um papel crítico para o IFN tipo I neste modelo ^11. Notavelmente, os critérios de definição para SLE humano incluem o desenvolvimento de nefrite compatível com SLE, na presença de anti-dsADN os anticorpos ^12, ambos os quais são características proeminentes deste modelo de ratinho.

Existem SEveral vantagens do modelo BM12 ao longo dos modelos espontâneos. Modelos clássicos que desenvolvam sinais LES-like espontaneamente dependem tanto linhagens de camundongos híbridos, linhagens puras não no fundo B6, ou grande loci genéticos no fundo B6, que fazem que cruzam a nocaute ou camundongos geneticamente modificado de outra forma difícil e demorado. Com o modelo indutível BM12, ratos geneticamente modificados podem servir quer como dador ou do receptor, permitindo a identificação mais rápida do compartimento celular em que os genes específicos podem ser importantes para a doença. Além disso, o desenvolvimento da doença no modelo BM12 é muito mais rápido, necessitando apenas de 2 semanas até ao aparecimento de ANA, em comparação a vários meses para os modelos mais espontâneas. Além disso, em contraste com os modelos espontâneos que desenvolvem a doença em diferentes pontos de tempo, o aparecimento e progressão da doença no modelo B6 BM12 → é altamente sincronizadas. Isto permite a geração de coortes de tamanho adequado que pode bE utilizada para estratégias de intervenção ou terapêuticos em qualquer fase do desenvolvimento da doença.

O que se segue é um protocolo detalhado para iniciar a auto-imunidade de LES como pela transferência adoptiva de linfócitos BM12 em ratinhos C57BL / 6, ou variantes genéticas no fundo B6. Além disso, descreve-se um protocolo de coloração de citometria de fluxo para enumerar TFH, GC células B, células do plasma e os tipos de células associadas com a doença humana. Mais importante, estes protocolos podem também ser utilizados para caracterizar doença na maioria dos modelos de rato de SLE e identificar TFH, GC células B e as células de plasma em outros modelos de doenças.

Protocol

Trabalho animal foi realizada em condições livres de patógenos específicos de acordo com diretrizes estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care Internacional e nossa Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). NOTA: Incorporar camundongos que expressam um marcador congénica como CD45.1 de cada doador ou animais receptores, se possível, porque isso permite a monitorização da eficiência doador do enxerto e expansão específica do…

Representative Results

Ratinhos doentes desenvolvem esplenomegalia em menos de 14 dias, apresentando os baços 2-3 vezes o tamanho dos ratinhos saudável em termos de massa e celularidade (Figura 2). Os esplenócitos são sequencialmente fechado na dispersão de luz (FSC-SSC-A por A), a eliminação de dupletos (FSC-W ou -H pelo FSC-A), células viáveis ​​(baixa coloração do corante de viabilidade) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Células dadoras são dis…

Discussion

O modelo induzível BM12 é uma maneira relativamente fácil e eficiente para estudar os processos celulares e moleculares do LES. A activação crónica de células T CD4 adoptivamente transferidos dirigidos contra auto-antigénios conduz à acumulação de TFH, GC células B, e células de plasma que pode ser medido por citometria de fluxo, tal como descrito aqui. Estudos futuros utilizando este modelo pode rapidamente e facilmente interrogar o papel dos genes candidatos e novas terapias nos processos centros germinat…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017