JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Voorbereiding en Fotoakoestisch Analyse van Cellular Voertuigen die goud nanorods

Published: May 02, 2016
doi:
10.3791/53328
, , , , , , , ,
1Institute of Applied Physics,Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences,University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy,University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology,University of Bologna

Summary

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Abstract

Goud nanorods zijn aantrekkelijk voor verschillende biomedische toepassingen, zoals de fotothermische verdamping en de fotoakoestische beeldvorming van kanker, dankzij hun intense optische absorptie in het nabije infrarood raam lage cytotoxiciteit en potentieel huis in tumoren. Echter, hun levering aan tumoren blijft een probleem. Een innovatieve aanpak bestaat uit de exploitatie van het tropisme van tumor-geassocieerde macrofagen die met goud nanorods in vitro kunnen worden geladen. Hier beschrijven we de voorbereiding en de fotoakoestische inspectie van cellulaire voertuigen met goud nanorods. GePEGyleerde goud nanorods worden gemodificeerd met quaternaire ammoniumverbindingen, om een ​​kationisch profiel te bereiken. Bij contact met de muizen-macrofagen in gewone petrischaaltjes, worden deze deeltjes gevonden om massale opname ondergaan in endocytische blaasjes. Vervolgens worden deze cellen zijn ingebed in biopolymere hydrogels, die worden gebruikt om te controleren of de stabiliteit van fotoakoestische conversievan de deeltjes wordt vastgehouden in hun cellulaire opname in voertuigen. We zijn ervan overtuigd dat deze resultaten nieuwe inspiratie voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om plasmonische deeltjes te leveren aan tumoren kan bepalen.

Introduction

In de afgelopen tien jaar hebben verschillende plasmonische deeltjes zoals goud nanorods, nanoshells en nanocages, veel aandacht gekregen voor toepassingen in de biomedische optica 1, 2, 3, 4. In strijd met de standaard goud nanobolletjes, deze nieuwere deeltjes resoneren in het venster nabij-infrarood (NIR), die voorziet in de diepste optische penetratie door het lichaam en de hoogste optische contrast dan endogene componenten 1. Deze functie is interessant voor innovatieve toepassingen, zoals de fotoakoestische (PA) beeldvorming en fotothermische ablatie van kanker gewekt. Echter, een aantal zaken te beperken de klinische penetratie van deze deeltjes. Bijvoorbeeld hun optische activatie beperkt echter hun oververhitting veroorzaken en hun functionele vormen naar meer sferische profielen, die een fotoinstabiliteit 5, 6, 7 aandrijft wijzigen, 8 </sup>, 9. Een ander probleem dat het wetenschappelijke debat domineert is hun systemische toediening in tumoren. In het bijzonder goud nanorods combineren formaten die ideaal zijn om tumoren die verbeterde doorlaatbaarheid en retentie en het gemak van conjugatie met specifieke probes van kwaadaardige markers weer doordringen zijn. Daarom wordt de voorbereiding van een directe injectie in de bloedstroom gezien als een mogelijke regeling 10, 11, 12, 13. Echter, deze route blijft problematisch, waarbij de meeste deeltjes raken gevangen door het mononucleaire fagocytsysteem 10, 11, 12. Bovendien, andere zorg is de optische en biochemische stabiliteit van de deeltjes na circulatie door het lichaam 14. Wanneer deeltjes verliezen hun colloïdale stabiliteit en aggregaat, kunnen hun plasmonische eigenschappen en warmteoverdracht dynamiek last van plasmonische koppeling 15, </sup> 16, 17 en 18 dwars-oververhitting.

Meer recent, de notie van het tropisme van tumor-geassocieerde macrofagen exploit heeft ontpopt als een slim alternatief 19, 20, 21. Deze cellen bezit zijn van een aangeboren vermogen om te detecteren en te doordringen tumoren met hoge specificiteit. Daarom kan men perspectief om deze cellen te isoleren uit een patiënt, laad ze met goud nanorods in vitro en injecteer die terug in de patiënt, met de bedoeling om ze te gebruiken als mobiele voertuigen belast met de levering. Een ander voordeel zou zijn om meer controle over de optische en biochemische stabiliteit van de deeltjes te verkrijgen, omdat hun biologische-interface worden geconstrueerd in vitro. Still, de prestaties van deze cellulaire voertuigen optische contrastmiddelen hebben een kritische analyse.

In dit werk beschrijven we de voorbereiding en de kritieke problemen van cellular voertuigen die goud nanorods voor de PA beeldvorming van kanker. GePEGyleerde goud nanorods worden gemodificeerd met quaternaire ammoniumverbindingen 22, om een kationisch profiel dat naar verwachting hun interacties met plasma membranen 23, 24 te bevor- deren. Deze deeltjes ondergaan efficiënt en niet-specifieke opname van de meeste cellulaire soorten, hopelijk zonder zich te bemoeien veel met hun biologische functies. Murine macrofagen worden geladen met tot wel 200, 000 kationische goud nanorods per cel, die opgesloten raken binnen strakke endocytische blaasjes. Deze configuratie moet bezorgdheid ontstaan ​​vanwege de dreiging van plasmonische koppeling en cross-oververhitting in deze blaasjes. Daarom worden de macrofagen ingebed in biopolymere hydrogels die biologische weefsels na te bootsen, om te controleren dat de meeste stabiliteit van PA omzetting van de deeltjes wordt vastgehouden in de overgang van het groeimedium de endocytische blaasjes. effective meetcriteria zijn uitgewerkt om de stabiliteit van PA omzetting onder omstandigheden van onmiddellijk belang voor beeldvorming PA meten. Een nieuwe vorm drempel ligt helemaal aan het begin van de optische instabiliteit na een trein van 50 laserpulsen met de typische herhalingssnelheid van 10 Hz.

We zijn ervan overtuigd dat deze resultaten momentum kunnen dienen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om plasmonische deeltjes te leveren aan tumoren.

Protocol

Opmerking: Alle concentraties van goud nanorods worden uitgedrukt in nominale Au molariteiten. Ter vergelijking met andere werken, mee dat 1 M Au ruwweg overeen met 20 uM goud nanorods, in ons geval. 1. Bereiding van kationische Gold nanorods Opmerking: De werkwijze begint met de synthese van cetrimoniumbromide (CTAB) -getermineerd goud nanorods de autokatalytische reductie van HAuCl 4 met ascorbinezuur, volgens het protocol geïntroduceerd door Nikoobak…

Representative Results

Hier is de haalbaarheid van cellulaire voertuigen die goud nanorods de PA beeldvorming van kanker getoond samen met typische resultaten van het protocol. De TEM beelden in figuur 1 tonen de gebruikelijke weergave van de deeltjes na stap 1 en hun cellulaire voertuigen na stap 2. De bereiding van de deeltjes en de cellen voor TEM beeldvorming elders 17 beschreven. Kationische goud nanorods ondergaan e…

Discussion

Het idee om tumor-geassocieerde macrofagen doel is in opkomst als een krachtig concept kanker 34, 35, 36 bestrijden. Hier, in plaats van de vernietiging, deze cellen worden gerekruteerd cellulaire voertuigen goud nanorods in een tumor te brengen, door de exploitatie van hun tropisme. Dit perspectief vergt een doordachte ontwerp van de deeltjes, hun integratie in de cellen en hun karakterisering. We hebben gevonden dat de fotostabiliteit van murine macrofagen geladen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Regione Toscana en de Europese Gemeenschap in het kader van de ERANET + Projecten LUS BEL en BI-TRE.

Materials

Hexadecyltrimethylammonium bromide Sigma-Aldrich H6269 To synthesize gold nanorods
Gold(III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918 To synthesize gold nanorods
Silver nitrate Sigma-Aldrich S6506 To synthesize gold nanorods
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960 To synthesize gold nanorods
Sodium borohydride Sigma-Aldrich To synthesize gold nanoseeds
MeO-PEG-SH Iris Biotech PEG1171 To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750 To PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide Sigma-Aldrich 733305 To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855 To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide
  Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287 To centrifuge PEGylated gold nanorods
PBS Lonza BE17-516F To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells
J774a.1 ATCC TIB-67 Monocyte/macrophage murine cell line
DMEM Lonza BE12-707F Cell culture medium
FBS Lonza DE14-801F To be added to cell culture medium
L-glutamine Lonza BE17-605E To be added to cell culture medium
Penicillin/streptomycin Lonza DE17-602E To be added to cell culture medium
Petri dish NEST 705001 Cell culture dish
Cell scraper EuroClone ES7018 To detach cells
Formaldehyde Fluka 47630 To fix cells
Chitosan, low molecular weight  Sigma-Aldrich 448869 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 306576 To insolubilize chitosan and generate the hydrogel
Polystyrene cell culture plates NEST 702011 Used as molds to fabricate chitosan hydrogels
Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser Continuum, Santa Clara, USA  Surelite OPO plus Source of optical excitation for photoacoustic tests
Pyroelectric detector  Gentec, Quebec, Canada QE8SP To monitor optical fluence for photoacoustic tests
Pre amplified needle hydrophone Precision Acoustic, Dorset, UK Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range To measure photoacoustic signals
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
  2. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
  3. Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
  4. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
  5. Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
  6. Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
  7. Chen, L. -. C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
  8. Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
  9. Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
  10. Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
  11. Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
  12. Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
  13. Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
  14. Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
  15. Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
  16. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
  17. Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
  18. Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
  19. Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
  20. Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin, ., Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
  21. Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
  22. Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
  23. Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
  24. Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
  25. Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
  26. Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
  27. Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
  28. Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
  29. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
  30. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
  31. Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
  32. Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
  33. Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
  34. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
  35. Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
  36. Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
  37. Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
  38. Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
  39. Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. Multi-membrane hydrogels. Nature. 452, 76-79 (2008).
  40. Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
  41. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  42. Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
  43. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  44. Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
  45. Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
  46. Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).

Tags

Gold NanorodsCellular VehiclesPhotoacoustic AnalysisTumor-associated MacrophagesPhotothermal TherapyPlasmonic ParticlesNanoparticle PurificationNanoparticle LoadingIn Vitro Cell Culture
check_url/kr/53328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C., Ratto, F., Centi, S., Cini, A., Lelli, B., Matteini, P., Pini, R. Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods. J. Vis. Exp. (111), e53328, doi:10.3791/53328 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image