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생체공학

Vorbereitung und photoakustische Analyse von Zell Fahrzeuge, die Gold-Nanostäbchen

Published: May 02, 2016
doi:
10.3791/53328
, , , , , , , ,
1Institute of Applied Physics,Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences,University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy,University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology,University of Bologna

Summary

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Abstract

Gold-Nanostäbchen sind attraktiv für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen, wie zum Beispiel die fotothermische Ablation und der photoakustischen Bildgebung von Krebs, dank ihrer intensiven optischen Absorption im nahen Infrarot-Fenster, niedrige Zytotoxizität und Potential zu Hause in Tumoren. Allerdings ist ihre Lieferung an Tumoren immer noch ein Problem. Ein innovativer Ansatz besteht aus der Ausbeutung des Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen , die mit Gold – Nanostäbchen in vitro geladen werden kann. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und die photo-akustischen Prüfung von Zellfahrzeuge Gold-Nanostäbchen enthält. PEGylierte Gold-Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen modifiziert, um eine kationische Profil zu erreichen. Bei Kontakt mit murine Makrophagen in gewöhnlichen Petrischalen werden diese Partikel gefunden massiven Aufnahme in endozytischen Vesikeln zu unterziehen. Dann werden diese Zellen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, die verwendet werden, um zu überprüfen, dass die Stabilität der photoakustischen Umwandlungsder Partikel wird in ihre Aufnahme in zelluläre Fahrzeugen beibehalten. Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse neue Inspiration für die Entwicklung neuer Strategien plasmonic Partikel zu Tumoren zu liefern liefern.

Introduction

Im Laufe der letzten zehn Jahre verschiedene plasmonic Partikel wie Gold – Nanostäbchen, Nanokugeln und Nanokäfige haben beträchtliche Aufmerksamkeit für Anwendungen in der biomedizinischen Optik 1, 2, 3, 4 empfangen. Abweichend von Standard – Gold – Nanokugeln, schwingen diese neueren Teilchen im nahen Infrarot (NIR) , welches 1 für tiefste optische Durchdringung durch den Körper und höchste optische Kontrast über endogene Komponenten. Dieses Merkmal hat das Interesse für innovative Anwendungen geweckt, wie der photoakustischen (PA) Bildgebung und die fotothermische Ablation von Krebs. Allerdings hemmen einige Probleme, die klinische Eindringen dieser Teilchen. Zum Beispiel neigt die optische Aktivierung ihre Überhitzung zu induzieren und ihre funktionelle Form zu mehr sphärischer Profile zu ändern, die eine Photoinstabilität 5 antreibt, 6, 7, 8 </sup>, 9. Ein weiteres Problem, das die wissenschaftliche Debatte dominiert, ist ihre systemische Zufuhr in Tumoren. Insbesondere Gold-Nanostäbchen kombinieren Größen, die zu pervade Tumoren sind ideal, die mit spezifischen Sonden von malignen Markern erhöhte Permeabilität und Retention und Leichtigkeit der Konjugation anzuzeigen. Daher ihre Vorbereitung für eine direkte Injektion in den Blutkreislauf wird als machbar Schema 10 wahrgenommen, 11, 12, 13. Jedoch bleibt dieser Weg problematisch, wobei die meisten der Partikel durch die mononukleären Phagozyten System 10 erfasst immer, 11, 12. Darüber hinaus ist ein weiteres Anliegen der optische und biochemische Stabilität der Partikel nach der Zirkulation durch den Körper 14. Wenn Teilchen ihre kolloidale Stabilität und Aggregat verlieren, ihre plasmonic Merkmale und Wärmeübertragungsdynamik von Plasmonen Kopplung leiden 15, </sbis> 16, 17 und Quer Überhitzung 18.

In jüngerer Zeit hat der Begriff den Tropismus von Tumor-assoziierten Makrophagen auszunutzen als intelligente Alternative 19, 20, 21 entstanden. Diese Zellen halten eine angeborene Fähigkeit, zu erkennen und zu durchdringen Tumoren mit hoher Spezifität. Daher kann eine Perspektive , diese Zellen von einem Patienten zu isolieren sein, sie mit Gold – Nanostäbchen in vitro laden und sie dann in den Patienten zu injizieren zurück, mit der Absicht , sie als zelluläre Fahrzeuge verantwortlich für die Lieferung zu verwenden. Ein weiterer Vorteil wäre, um mehr Kontrolle über die optische und biochemische Stabilität der Partikel zu gewinnen, weil ihre biologische Schnittstelle würde in vitro konstruiert werden. Dennoch müssen die Leistungen dieser zellulären Fahrzeuge als optische Kontrastmittel eine kritische Analyse.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Vorbereitung und die wichtigsten Fragen von Cellular Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält. PEGylierte Gold – Nanostäbchen sind mit quartären Ammoniumverbindungen 22, modifiziert , um ein kationisches Profil zu erreichen, die ihre Wechselwirkungen erwartet wird , mit plasmatischen Membranen 23, 24 zu fördern. Diese Partikel gehen effiziente und unspezifische Aufnahme von den meisten Zellarten, hoffentlich ohne viel mit ihren biologischen Funktionen zu stören. Murine Makrophagen geladen werden mit bis zu mehr als 200, 000 kationische Gold-Nanostäbchen pro Zelle, die in engen endocytic Vesikel eingeschlossen sein. Diese Konfiguration sollte Sorge entstehen, wegen der Gefahr von Plasmonen Kupplung und Quer Überhitzung im Inneren dieser Vesikel. Daher werden die Makrophagen in biopolymeren Hydrogele eingebettete, das biologische Gewebe zu imitieren, um zu verifizieren, dass der größte Teil der Stabilität der PA-Umwandlung der Teilchen in der Übertragung aus dem Wachstumsmedium zu den endozytischen Vesikel zurückgehalten wird. effective Messkriterien sind, um die Stabilität der PA-Umwandlung unter Bedingungen von unmittelbarem Interesse für PA-Bildgebung zu messen, ausgearbeitet. Eine Umformung Schwelle in den Anfängen der optischen Instabilität nach einem Zug von 50 Laserpulse mit der typischen Wiederholungsrate von 10 Hz eingestellt.

Wir sind zuversichtlich, dass diese Ergebnisse Impulse für die Entwicklung neuer Strategien zur Verfügung stellen können Plasmonen Partikel zu Tumoren zu liefern.

Protocol

Hinweis: Alle Konzentrationen von Gold-Nanostäbchen werden in Form von nominal Au Molarität ausgedrückt. Zum Vergleich mit anderen Arbeiten zu beachten, dass 1 M Au entspricht in etwa 20 & mgr; M Gold-Nanostäbchen, in unserem Fall. 1. Herstellung von kationischen Gold-Nanostäbchen Hinweis: Das Verfahren beginnt mit der Synthese von Cetrimoniumbromid (CTAB) -capped Gold – Nanostäbchen durch die autokatalytische Reduktion von HAuCl 4 mit Ascorbin…

Representative Results

Hier wird die Machbarkeit der zellulären Fahrzeuge Gold-Nanostäbchen für die PA-Bildgebung von Krebs enthält, wird zusammen gezeigt mit typischen Ergebnisse des Protokolls. Die TEM – Aufnahmen in Abbildung 1 zeigen die übliche Erscheinung der Partikel nach dem Schritt 1 und ihre zellulären Fahrzeuge nach Schritt 2. Die Herstellung der Partikel und der Zellen für TEM – Aufnahmen wird an anderer Stelle <s…

Discussion

Der Begriff tumorassoziiertes Makrophagen zeichnet sich als ein leistungsfähiges Konzept zu zielen 34 Krebs zu bekämpfen, 35, 36. Hier kann anstelle ihrer Zerstörung sind diese Zellen als zelluläre Fahrzeuge rekrutiert Gold-Nanostäbchen in einen Tumor zu bringen, durch die Ausnutzung ihrer Tropismus. Diese Perspektive erfordert eine durchdachte Design der Partikel, deren Integration in die Zellen und deren Charakterisierung. Wir haben festgestellt, daß die Pho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde teilweise von der Region Toskana und der Europäischen Gemeinschaft im Rahmen des ERANET + Projekte LUS BUBBLE und BI-TRE unterstützt.

Materials

Hexadecyltrimethylammonium bromide Sigma-Aldrich H6269 To synthesize gold nanorods
Gold(III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918 To synthesize gold nanorods
Silver nitrate Sigma-Aldrich S6506 To synthesize gold nanorods
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960 To synthesize gold nanorods
Sodium borohydride Sigma-Aldrich To synthesize gold nanoseeds
MeO-PEG-SH Iris Biotech PEG1171 To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750 To PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide Sigma-Aldrich 733305 To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855 To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide
  Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287 To centrifuge PEGylated gold nanorods
PBS Lonza BE17-516F To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells
J774a.1 ATCC TIB-67 Monocyte/macrophage murine cell line
DMEM Lonza BE12-707F Cell culture medium
FBS Lonza DE14-801F To be added to cell culture medium
L-glutamine Lonza BE17-605E To be added to cell culture medium
Penicillin/streptomycin Lonza DE17-602E To be added to cell culture medium
Petri dish NEST 705001 Cell culture dish
Cell scraper EuroClone ES7018 To detach cells
Formaldehyde Fluka 47630 To fix cells
Chitosan, low molecular weight  Sigma-Aldrich 448869 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 306576 To insolubilize chitosan and generate the hydrogel
Polystyrene cell culture plates NEST 702011 Used as molds to fabricate chitosan hydrogels
Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser Continuum, Santa Clara, USA  Surelite OPO plus Source of optical excitation for photoacoustic tests
Pyroelectric detector  Gentec, Quebec, Canada QE8SP To monitor optical fluence for photoacoustic tests
Pre amplified needle hydrophone Precision Acoustic, Dorset, UK Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range To measure photoacoustic signals
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Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C., Ratto, F., Centi, S., Cini, A., Lelli, B., Matteini, P., Pini, R. Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods. J. Vis. Exp. (111), e53328, doi:10.3791/53328 (2016).
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