הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.
Abstract
מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן 1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם 2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית 3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית 7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.
Introduction
ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי.
שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H & E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת 2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים.
חתך של הריאה ואחרי צביעת H & E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר.
כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים 8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות 9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות 10. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי 9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת 9,10.
היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המעבדה יה נתמכת על ידי מימון מחקר מאגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (IRG-97-219-14) הוענק למרכז הסרטן הולינגס בMUSC, על ידי מימון מחקר ממענק משרד ההגנה (W81XWH-11-2- 0229) בMUSC, ועל ידי פרסים מדאגת הקרן (לESY).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. Modeling metastasis in the mouse. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
- Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).
