Laserstyrda Neuronal spårning i Brain Explantat
Summary
Vi beskriver en teknik för att märka nervceller och deras processer via antero eller bakåtsträvande spår injektioner i hjärnkärnor med hjälp av ett in vitro-beredning. Vi ändrade en befintlig metod för v vitro tracer elektroporering genom att utnyttja fluorescerande mutanter mus och grundläggande optisk utrustning för att öka märkning noggrannhet.
Abstract
Vi presenterar en teknik som kombinerar ett in vitro spårinjektionsprotokoll, som använder en serie av elektriska och tryckpulser för att öka färgupptagning genom elektroporering i hjärnan explantat med riktade laserbelysning och matchande filterglasögon under proceduren. Den beskrivna tekniken med in vitro-elektroporering av sig själv ger relativt god visuell kontroll för målsökande av vissa områden i hjärnan. Genom att kombinera den med laser excitation av fluorescerande genetiska markörer och deras utläsning genom band passerar filterglasögon, som kan plocka upp utsläppen av de genetiskt märkta celler / kärnor och fluorescerande spåra färgämnet kan en forskare avsevärt öka noggrannheten injektioner genom att finna området av intresse och styrning för det färg spridning / upptag i injektionsområdet mycket mer effektivt. Dessutom tillåter den laserbelysning teknik för att studera funktionen hos en given neurocircuit av provIding information om vilken typ av neuroner som skjuter ut till ett visst område i fall där GFP-uttryck är kopplat till den typ av sändare uttrycks av en underpopulation av neuroner.
Introduction
För att definiera en viss neuronal (mikro) krets, måste man börja med att hitta de olika deltagarna i kretsen, och deras anslutningsmönstret. Ända sedan Wallers publikation om neurofiber spårning genom lesionering en ett stort utbud av neuroanatomiska spårningsteknik har etablerats. Några av dessa tekniker kan tillämpas i fixerad vävnad efter slakt 2-4, andra förlitar sig på den aktiva transporten av färgämnet i levande neuroner, som upptäcktes i 1971 5-6. Det senare kan delas upp ytterligare i två grupper diskriminerande mellan metoder som utnyttjar aktiv retrograd (från det injicerade området till källan av en viss projektion, dvs. Somata av nervceller som skjuter till nämnda område) och aktiv antero (från den injicerade området till målet om en viss projektion, dvs. de axonal prognoser och axonal plintarna märkta neuroner) transport. Också, i vissa fall tracer material injiceras i levande djur som sedan överlever injektionen av flera dagar eller veckor (in vivo spår injektioner), medan det i andra fall explanterade hjärnor injiceras och inkubera under flera timmar efter injektionen i artificiell cerebrospinalvätska (in vitro spår injektioner) .
I detta protokoll ändrade vi en befintlig in vitro elektroporering teknik 7-8 att märka neuronal somata och processer i antero och bakåtsträvande spårning experiment med choleratoxin subenhet-b och tetrametylrodamin dextran som spårnings ämnen. Det övergripande målet med detta protokoll är att ge neuroforskare med ett effektivt verktyg för att spåra neuronala anslutningsmönster mellan olika hjärnkärnor, samtidigt dra nytta av tillgängliga transgen mus linjer och grundläggande optisk utrustning för att öka inriktning noggrannhet under spår injektioner. Även metoden för antero och bakåtsträvande spårning med hjälp avcholeratoxin och dextran amin och deras respektive fluorescensmärkta konjugat är inte ny 9-13 (som är metoden för elektroporering, t.ex.. Haas et al., 14), varvid kombinationen av spår injektioner med elektroporering i en in vitro beredning inbegriper block av hjärnvävnad är en senare utveckling 7. Dess främsta fördel jämfört med neuronala spårning tekniker med samma typ av spår färgämnen med levande djur är den ökade märkningsintensiteten, på grund av den högre effektivitet med vilken electroporated färgämnet tas upp av nervceller. En ytterligare fördel är en förkortad inkubationstiden (krävs för färgämnet transport) och dess ökade mål noggrannhet under spårämnesinjektion, eftersom laboratoriet har visuell kontroll över målområdet av injektionen. Det senare innebär också att ingen dyr stereotaktisk utrustning krävs för att hitta kärnan eller hjärnan intresseområde.
Till ytterlifall öka inriktning noggrannhet, vi drog fördel av en transgen mus linje, som uttrycker GFP i sin glycinerga subpopulation av neuroner 15 och grundläggande optisk utrustning består av en handhållen laserpekare av 405 nm våglängd och matchande bandpassfiltrerings glasögon (450 – 700 nm). Därmed nådde vi en betydande ytterligare ökning av inriktning noggrannhet genom att identifiera injektionsstället genom sin fluorescerande signal och genom att tillhandahålla ett finare sätt att kontrollera för färgämnet sprids inom injektionsstället genom observation av samspelet mellan den inhemska GFP signalen och spår fluorescens. Vår teknik gör det också möjligt att avslöja funktionaliteten hos en krets tillsammans med sin anslutning genom att identifiera GFP-positiva hämmande neuroner (eller stimulerande i andra muslinjer) som fylldes med spårämnet.
Sammanfattningsvis, förbättrade vi ytterligare ett kraftfullt neurovetenskaplig verktyg för att studera connectome av ryggradsdjur hjärnan och bedöma than olika neuroanatomiska egenskaperna hos en given neurocircuit. Genom att använda transgena möss tillsammans med billiga och lättillgängliga optisk utrustning kunde vi avsevärt öka den målsökande noggrannheten i våra injektioner. Dessutom transgena möss tillät oss att identifiera typen av spåras anslutningar, som hjälpte avslöja funktionaliteten hos en hämmande mikrokrets i hörselhjärnstammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
En allmän styrka in vitro-spårämne elektroporation, i motsats till in vivo spårning studier, är att den ger forskarna bättre tillgång till hjärnan området av intresse och därmed inte innebär dyra stereotaktisk (och ofta elektrofysiologiska) utrustning. Dessutom överlevnad tid som krävs för hjärnan explantaten spänner bara några timmar (1 – 4) istället för dagar eller veckor i fallet med in vivo spår injektioner (se en detaljerad genomgång av användningen av dextran aminer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging experiment utfördes i University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kärna stöds delvis av NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antal UL1 RR025780 och Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kärna Center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac från Salk Institute försett oss med GlyT2-GFP möss.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. . Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
