Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Bir doğru akım elektrik alanda (dcEF) kapsamında yönlü hücre göçü davranışı electrotaxis olarak adlandırılır. Embriyo gelişimi, hücre farklılaşması ve yara iyileşmesi sırasında hücre hareketi rehberlik fizyolojik dcEF önemli rolü birçok çalışmada gösterilmiştir. Bir electrotaxis tahlil mikroakışkan cips uygulayarak, soruşturma süreci kısalır ve deneysel hatalar en aza indirilir. Son yıllarda, mikroakışkan cihazlar polimerik maddeler (örneğin, polimetilmetakrilat, PMMA, veya akrilik) ya da polidimetilsiloksan (PDMS), yaygın olarak, elektrikli uyarılmaya verilen hücre yanıtları incelenmesinde kullanılmıştır yapılmıştır. Bununla birlikte, bir PDMS cihazı oluşturmak için gereken çok sayıda adımları farklı olarak, uidic çip fl akrilik mikro basit ve hızlı bir yapım aygıtı prototip ve üretim hem de uygundur. Oysa bildirilen cihazların hiçbiri aynı anda kimyasal ve DCE verimli çalışma kolaylaştırmakHücreler üzerindeki F etkileri. Bu raporda, bizim tasarım ve akciğer kanseri hücreleri üzerinde kimyasal ve elektriksel stimülasyon eşzamanlı etkisini araştırmak için akrilik bazlı çok kanallı çift elektrik alan (MDF) yonganın imalat açıklar. MDF yonga tek bir testle elektrik / kimyasal uyarılara sekiz kombinasyonları içerir. Çip ölçüde gerekli deneysel süresini kısaltır hem de electrotaxis çalışmalarda doğruluğu artırır.
Introduction
Bir doğru akım elektrik alanda (dcEF) altında anot ya da katot doğru hareket yapışan hücrelerin davranışı electrotaxis olarak adlandırılır. Hücrelerin electrotactic davranışı embriyojenez, sinir rejenerasyonu ve yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Bu tür sıçan prostat kanseri hücreleri, 2 göğüs kanseri hücrelerinin, 3 ve akciğer adenokarsinoma hücreleri 4-8 olarak 1 tümör hücreleri uygulanan dcEF altında electrotactic hareketi göstermiştir . Fizyolojik EF bezi dokularda ölçülmüştür. 9,10 Electrotaxis da bezi ile ilişkili tümör hücrelerinde bildirilmiştir. 2,3 kanser hücrelerinin electrotaxis metastaz faktörü olduğu kabul edilir, birlikte ele alındığında. 11 elektriksel yol kontrol dcEF altına kanser hücreleri kanser gelecekteki tedavisi için potansiyel bir yaklaşım olabilir. Ancak günümüzde electrotaxis ayrıntılı moleküler mekanizması hala tartışmalıdır. Bu nedenle, inf bir soruşturmakanser hücre göç elektrik stimülasyonu luence kanseri tedavisi için stratejiler geliştirilmesini kolaylaştırabilir.
Son zamanlarda, biyo-mikroakışkan cihazlar in vitro, 12 kimyasal geçişlerini, 13 ve elektrik uyaranlar 4 kesme kuvveti akış hücresel yanıtları eğitim için imal edilmiştir. (Aynı zamanda akrilik olarak da bilinen PMMA) polidimetilsiloksan (PDMS) veya polimetilmetakrilat kullanarak biyo-mikroakışkan cihazların imalatı başarıyla tür deneylerin başarısızlık oranı azalmıştır. Ayrıca, biyolojik konuları araştırmak için bir prototip olarak akrilik esaslı mikroakışkan cihazlar kullanarak PDMS yongaları kullanarak daha basittir. Akrilik bazlı cihazların çeşitli fonksiyonları electrotaxis çalışma için geliştirilmiştir. Ancak, önceki tasarımlara hiçbiri aynı anda electrotaxis çalışma için hücreler üzerinde çeşitli kimyasal koşulların etkilerini ve elektrik-alan test edebiliyoruz. Böylece, bir mikroakışkan cihaz mu geliştirdiltichannel çift elektrik alan (MDF) çip içeren dört bağımsız kültür kanalı ve bir çip sekiz farklı deneysel koşullar.
İlk Hou tarafından bildirilen akrilik esaslı MDF yonga, vd., 8 elektrik stimülasyonu ve çeşitli kimyasal izole kanalları bütünleştirir. Bu kimyasal olarak izole kanal, bir deney kültür hücreleri farklı kullanılabilir. Kanallarda dcEF bir elektrik güç kaynağı tarafından üretilir. İki bağımsız elektrik alanlar, uygulanan elektrik alan kuvveti (EFS) ve 0 EFS ile diğeriyle, her kimyasal izole kanalda yapılmaktadır. Bu şekilde çip daha kontrollü eşlik eden EF ve kimyasal uyarım içerir. Ayrıca, MDF çip içerisindeki kimyasal difüzyon sayısal simülasyon sonuçları çapraz kontaminasyon 24 saat deney süre sonra kanallar arasında meydana geldiğini göstermektedir. 8
Devi ile karşılaştırıldığındaLi tarafından rapor ce ve diğ., 14 MDF çip elektriksel olarak uyarılmış hücrelerin daha da biyokimyasal analiz için izin veren daha geniş bir kültür alanı içerir. Buna ek olarak, MDF çip büyük gözlem alanı ile daha fazla hücre test gözlemlenebilir, yani elektrikle uyarılan hücrelerin göç hızı ve yönetme analizi daha doğrudur. Huang ve ark., 4 ve Tsai ve ark., 15 tarafından bildirilen daha önceki çalışmalar, tek kanal çip tasarımı hücre ya da kimyasal yalnızca tek bir tip test edilmesini sağlar. Bununla birlikte, MDF çip electrotaxis çeşitli kimyasal etkilere, ve aynı zamanda farklı hücre tipleri üzerinde elektriksel uyarım etkilerini araştırmak için kullanılabilir. Diğer bir deyişle, MDF çip kimyasal doz bağımlılıkları etkin çalışma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz zor olması MDF yonga Layer 1 üzerine akrilik adaptörleri kalarak sürecini bulundu. Süper yapıştırıcı sadece 1 ila 2 ul uygulama sıkıca MDF çip üzerine adaptörü uyması yeterlidir. Tutkal Büyük miktarlarda süper yapıştırıcı ve bağlı başarısızlık tamamlanmamış bir polimerleşmesinde sonuçlandı. Akrilik adaptörleri sıkıca MDF çip üzerine yapıştırılır Bir kez, mikroakışkan sistemde sıvı kaçağı nadiren meydana geldi. Buna ek olarak, vakum odasının içine O / N inkübas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
