Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Tavuk embriyo kullanarak doğrudan büyüme faktörleri ya da gen ekspresyonu ve sinyal transdüksiyon yollarının aktivasyonu ile ilgili sinyal yollarının spesifik inhibitörleri ya da etkilerini test etmek mümkündür. Bu teknik, belirli zamanlarda için kesin olarak tanımlanmış gelişim aşamalarında sinyal molekülleri teslim izin verir. Bu embriyolar, hasat edilmiştir ve gen ekspresyonu in situ melezleme ya da immün ile gözlemlenen sinyal transdüksiyon yollarının aktivasyonu, örneğin, incelenebilir sonra.

U0126, bir MEK inhibitörü batırılmış bu FGF18 batırılmış bir video heparin boncuk veya AG 1-X2 boncuk, ovo ekstremite tomurcuk içine aşılı edilir. Bu FGF18 U0126 tarafından inhibe edilir MyoD ve ERK fosforilasyonu ve endojen ve FGF18 kaynaklı hem MyoD ekspresyonunu uyardığını göstermektedir. Bir retinoik asit antagonisti batırılmış Boncuk FGF18 tarafından prematüre MyoD indüksiyon potansiyalize edebilir.

Bu yaklaşım bize olabilirFarklı büyüme faktörleri ve inhibitörleri ve geniş bir yelpazesi ile ed de gelişmekte olan embriyonun diğer dokularda uyarlanmıştır.

Introduction

Kuş embriyolar yıllardır ¹ gelişim çalışma için güçlü bir araç sağladı. Bunların en yararlı özelliklerinden biri bunların manipüle edilmeleri nispeten kolay olmasıdır. Dış gelişimi, hücre kaderine ^2,3 çalışmak için klasik bir bıldırcın piliç kimera sistemi olarak örnekler dahil olmak üzere çeşitli micromanipulations embriyo ulaşmak için yumurta açıp gerçekleştirmek mümkün kılar, geliştirme ^4,5 sırasında belirli dokularda aşırı ekspresyona yönelik retrovirüslerin enjeksiyonu ve eksplant kültürü gelişimsel sinyal kaynaklarını ⁶ tanımlamak için. Daha yakın zamanlarda GFP ifade transgenik tavuk hattından greft ile etiketsiz bilgisayarlar arasında oluşturulan kimeralardır klasik aşılama ve genetik modifikasyon kombinasyonu gelişimi ^7,8 dair önemli bilgiler sağlayabilir göstermiştir.

Kuş embriyo manipüle edilebilir kolaylığı uzuv incelemek için o mükemmel bir model yapmıştırgelişimi ^9. In vivo gelişmekte bacaklarda özgü büyüme faktörlerinin uygulanması bacak desenlendirme ^10,11 değiştirebilir ve bu sürecin ¹² içgörü sağlamaya devam faktörlerin belirlenmesinde etkili olmuştur. Bu yaklaşım aynı zamanda, kas gelişimini düzenleyen faktörleri incelemek için kullanılır olmuştur ve böyle Wnts ^13, BMP ¹⁴ ve HGF ¹⁵ gibi sayısız sinyaller için roller ortaya çıkardı.

Son zamanlarda bu teknik, bacak tomurcuk miyojenik gen ekspresyonunu kontrol sinyalleri araştırmak için kullanılmıştır ve FGF18 ve retinoik asit arasındaki etkileşimler MyoD ekspresyonu ¹⁶ zamanlamasını kontrol göstermiştir. Boncuklar üzerine yüklendi ve daha sonra belirlenen gelişim aşamalarında spesifik dokular doğrudan aşılanabilir büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin bir kombinasyon kullanılarak gelişimi esnasında hemen hemen her zaman ve bölge müdahale imkanı verir. Bu inve için kullanılmıştırhücre gruplarının desenlendirme ^17,18, nöral şartnamede ^19, nöral krest göç ²⁰ ve eksen uzantısı ²¹ dahil olmak üzere birçok süreçleri stigate.

Burada tavuk bacaklarda gelişmekte olan ya da büyüme faktörleri ya da inhibitörlerin batırılmış boncuklar aşılama için bir yöntem tarif eder. Bu in situ hibridizasyon ile, kas spesifik gen ekspresyonunu analiz ederek Miyogenesis bu sinyallerin etkisini belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Bu tür retinoik asit veya belirli bir sinyal yollarının küçük molekül inhibitörleri olarak küçük hidrofobik moleküller için büyüme faktörleri ya da AG 1-X2 boncuklar için kullanılan heparin batırılmış boncuklar, kullanılarak greft tarif eder. Bununla birlikte, diğer boncuklar da FGF'ler ^{22 ve 23,} her iki Shh teslim etmek için kullanılmıştır temin edilebilmektedir.

Protocol

Etik Beyanı: Bütün bu deneyler hayvan bakımı ve Nottingham Üniversitesi etik kurallara uyun. Tırnak için Heparin Boncuk 1. Hazırlık Kullanmadan önce PBS içinde iyice heparin boncuk yıkayın. Not: boncuk PBS içinde bir çamur olarak 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. PBS, 1 ml damla bir 20 ul pipet ile stoktan bunları kaldırarak aşılama için boncuk seçin. Daha sonra 3 santimetrelik bir petri tabağına PBS 20 ul damla içine boncuk akt…

Representative Results

HH aşamada 21 MyoD boyama gelişmekte Somitlerin (Şekil 1A) miyotom gözüyle görülebilir, ancak bacak miyoblastlar geliştirilmesinde ifade değildir. Şekil 1B, bir FGF18 kordon greft, aşağıdaki MyoD 6 saat boyunca in situ hibridizasyon gösterir. Karşı bacak bir ifade yoktur ise MyoD boncuk yakın miyoblastların indüklenir. U0126 batırılmış bir boncuk, MEK, MyoD (Şekil 1C) bloklar FGF18 indüksiyon spesifik bir inhibitörü olan Co-aşılama….

Discussion

Ovo dokuların geliştirilmesi için doğrudan uygulanabilir boncuk greft kullanımı, uygulandıkları hangi gelişim aşamasında ve pozlama süresi boyunca eşsiz kontrol vererek gelişim sırasında büyüme faktörü sinyalizasyon rolünü incelemek için güçlü bir araçtır.

Molekülünün her türü için boncuk seçimi önemlidir. Her ampirik bu boncuklar üzerinde inhibitör etkinliğini test etmek için gerekli olmasına rağmen, burada anlatılan önleyicileri ve retinoik asit …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS