Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
Aangezien gespecialiseerde mobiele immuuncellen, planten gebruiken hun gelokaliseerd geprogrammeerde celdood en Systemic Acquired Resistance zich te verdedigen tegen de pathogene aanval. De bijdrage van specifieke Arabidopsis gen de gehele installatie immuunreactie kan specifiek en kwantitatief bepalen van het pathogeen groei binnen het geïnfecteerde weefsel geëvalueerd. Voor meer dan drie decennia is de hemibiotrophic bacterie Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) op grote schaal toegepast als het model ziekteverwekker naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de Arabidopsis immuunrespons te onderzoeken. Ziekteverwekkers in het blad weefsel te leveren, hebben meerdere enting methoden is vastgesteld, bijvoorbeeld, spuit infiltratie, dip inenting, spray, vacuüm infiltratie en vloed inenting. Het volgende protocol beschrijft een geoptimaliseerde injectiespuit infiltratie methode om virulente Psm ES4326 leveren in bladeren van volwassenbodem geteelde Arabidopsis planten en nauwkeurig scherm voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) in de richting van deze ziekteverwekker. Bovendien kan dit protocol worden aangevuld met meerdere pre-behandelingen verder te ontleden specifieke immuun gebreken binnen verschillende lagen van de verdediging van planten, met inbegrip van salicylzuur (SA) -Triggered Immuniteit (STI) en MAMP-Triggered Immunity (MTI).
Introduction
Door hun sessile aard zijn installaties voortdurend bedreigd door een overvloed aan ziekteverwekkers vertonen verschillende leefstijlen en voedingswaarde strategieën 1. Om een eerste benadering, biotrofe ziekteverwekkers behouden hun gastheer in leven om voedingsstoffen te halen, terwijl necrotrofe ziekteverwekkers actief geheim toxines en enzymen aan gastheerweefsel doden en voeden zich met de dode cellen 1. Een andere groep van ziekteverwekkers, genaamd hemibiotrophs begint hun infectie uiteraard met biotrofe podium en verschuift naar de necrotrofe podium op een bepaalde drempel van pathogeen accumulatie 2 bereiken. Om zich te verdedigen tegen deze micro-organismen, planten hebben een ingewikkelde aangeboren immuunsysteem uitgerust met meerdere toezichtmechanismen het pathogeen aanval detecteren en trigger ontwikkeld gelokaliseerde geprogrammeerde celdood 3 en systemische verworven resistentie (SAR) 4. Lopend onderzoek is gericht op het karakteriseren van de essentiële signaling componenten en cross-gesprekken binnen de plant immuunsysteem 5.
Zoals in de "Zig-Zag" model 5 voorgesteld, de eerste laag van de plant aangeboren immuunrespons vereist de aanwezigheid van plasma-gelokaliseerde receptoren Pattern Recognition (PRRS) om de invasie van microben te detecteren. PRRS kunnen Microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs) erkennen en vast MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Naast het induceren van een transcriptionele opregulatie van genen die coderen voor antimicrobiële PR proteïnen 7, MTI leidt tot een verscheidenheid van gebeurtenissen die de groei van pathogenen, waaronder de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Reactive stikstofspecies (RNS), afzetting van callose aan de celwand arrestatie alsook de activering van meerdere kinase signaalwegen 8.
Tot nu toe zijn verscheidene MAMPs geïdentificeerd aan MTI veroorzaken bij Arabidopsis, waaronder bacteriële flg22 9 </sup> (Een 22 aminozuur fragment afgeleid van flagelline), elf18 10 (18 aminozuren van de bacteriële vertaling elongatiefactor Tu) en een structureel celwandcomponent Peptidoglycanen 11. Om een succesvolle infectie vast te stellen, hebben een aantal gespecialiseerde pathogenen de mogelijkheid om geheime virulentie effector eiwitten geëvolueerd in de intracellulaire en intercellulaire ruimten, en dus MTI onderdrukken en trigger Effector-Triggered Susceptibility (ETS) 12,13. Zo kan virulentie effectoren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) fosforylatie cascades van MTI inactiveren om de ziekteontwikkeling bij het geïnfecteerd weefsel 14-16 induceren. Tijdens de dynamische co-evolutie tussen gastheren en pathogenen, planten ontwikkelde ook de tegenaanval strategie om de effector-eiwitten herkennen en verzwakken de ziekteverwekker virulentie moleculen 17. Deze directe of indirecte effector erkenning wordt gemedieerd door ziekteresistentie (R) 18 eiwitten. De meeste tboord zijn lid van de NB-LRR (Nucleotide Binding en leucine-rijke herhalingen) gezin 19. De perceptie van een avirulent effector door een R-eiwit lokt een sterkere en bredere immuunrespons gekenmerkt als Effector-Triggered Immunity (ETI) 20. Naast het induceren van de expressie van verdedigingsgenen 21 en de productie van metabolieten verdediging 22, ETI leidt vaak tot een snelle gelokaliseerde geprogrammeerde celdood genoemd overgevoeligheidsreactie (HR) het pathogeen mag niet in het aangrenzende weefsel 3 te beperken.
Naast de gelokaliseerde geprogrammeerde celdood 23 planten zijn in staat tot het initiëren van een langdurige en systeembrede immuunreactie genoemd Systemic Acquired Resistance (SAR) 4. Bij provocatie met biotrofe pathogeen, plantencellen leiden tot de biosynthese en de accumulatie van een endogeen plantenhormoon salicylzuur (SA) en PR proteïnen in zowel lokale en systemische weefsels 24. DezZijn werkwijze wordt een verhoogde staat van paraatheid bereikt de geïnfecteerde bladeren die het mogelijk maakt de montage sneller verdedigingsresponsen bij een volgende infectie door een breed spectrum van pathogenen 24. SA en zijn synthetische analogen zoals benzo- (1,2,3) -thiadiazol-7-carbothiozuur S methyl ester (BTH) en 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) kunnen chemisch induceren salicylzuur (SA) -Triggered Immunity (STI) op externe applicatie 24. Nonexpressor van pathogenese verwante genen 1 (NPR1) wordt voorgesteld als een van de SA receptoren en werkt als een belangrijke transcriptionele regulator during SA-gemedieerde verdediging respons in zowel lokale als systemische weefsels 21,25,26 zijn. Er is overtuigend aangetoond dat NPR1 nodig voor SAR inrichting en het verlies van NPR1 leidt tot dramatische gevoeligheid richting Pseudomonas syringae 25.
Om op grote schaal te karakteriseren van de moleculaire bijdrage van plantaardigecomponenten in de plant-pathogeen interacties, zijn meerdere bioassays ontwikkeld om specifieke afweer gebeurtenissen te meten, met inbegrip van ROS barsten 27, callose afzetting 28, defensie genen expressie en accumulatie van hun eiwitproducten 21. Hoewel deze individuele testen inzicht kunnen geven in een specifieke vorm van de plant immuunrespons, geen ervan zijn echter in staat de volledige afweerreactie op het hele plant niveau te vertegenwoordigen. Omgekeerd kwantificering van pathogene groei na infectie geeft een algemene inschatting van de immuunrespons op het organismale niveau. Daarom is de ontwikkeling en optimalisatie van een nauwkeurige en zeer gestandaardiseerde pathogeen inoculatie test is kritisch voor tanken onderzoek en ontdekkingen op het Arabidopsis immuunreacties.
Pseudomonas syringae, een Gram-negatieve bacterie, werd geïdentificeerd als fytopathogenen kunnen veroorzaken ziekte bij een reeks van plantaardige gastheren Arabidops29 is. Als modelplant-pathogeen-systeem, de Arabidopsis – P. syringae interactie is op grote schaal toegepast om de moleculaire mechanismen te begrijpen onderliggende verdediging van planten reacties 29. Tot nu toe meer dan 50 P. syringae pathovars zijn geïdentificeerd op basis van hun vermogen om verschillende plantensoorten 30 infecteren . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 en P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 zijn de twee meest gebruikte en uitgebreid gekarakteriseerd virulente stammen. Afgezien van wordt erkend door de plant en triggeren de MTI reactie, Pst DC3000 en Psm ES4326 kunnen uitscheiden virulente effector eiwitten aan MTI onderdrukken en leiden ETS aan de pathogeen groei 31,33 bevorderen.
Functioneel ontleden de interactie tussen Arabidopsis en P. syringae, multiple0; pathogeeninfectie werkwijzen zijn ontwikkeld op basis van het pathogeen levering aanpak. Voor-grond geteelde planten, kan pathogeen worden geleverd met een spuit infiltratie, vacuüm infiltratie, dip inenting en spuit inenting 29,34. Onlangs werd seedling vloed inoculatie assay ontwikkeld voor grootschalige schermen voeren op weefselkweekplaten volwassen jonge Arabidopsis planten 35. Spuit infiltratie, als een van de meest gebruikte aanpak levert handmatig organisme in de apoplast via natuurlijke openingen blad genoemd huidmondjes 29. Door deze benadering gelijke hoeveelheden P. syringae kunnen worden geïnfiltreerd in de geïnfecteerde blad en de kracht van planten immuunrespons is omgekeerd gecorreleerd met de pathogeen groei levels. Daarom kwantificering van pathogeen groei dient als een optimale aanpak van het immuunsysteem te evalueren op het hele plant niveau. Bovendien kunnen spuit infiltratie lokale en systemische weefsels te onderscheiden, die be in het karakteriseren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen SAR 36 van toepassing.
In de volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde spuit infiltratie test met Psm ES4326 tot Arabidopsis mutanten voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) te screenen. Dit protocol zal twee Arabidopsis genotypen in dienst: een wild-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planten (controle) en npr1-1 verlies-van-functie mutanten (hypersusceptible) dat zal worden geïnfecteerd met virulente bacteriële stam Psm ES4326 37. De npr1-1 mutant draagt een puntmutatie in de ankyrine-repeat consensussequentie van NPR1 molecuul, dat de sterk geconserveerde histidine tot tyrosine verandert en maakt het eiwit niet-functioneel 25. Daarnaast is een aantal modificaties van de injectiespuit infiltratie assay beschreven die kwantificering van defecten in specifieke lagen van de immuunrespons, zoals MTI en STI toestaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met afnemende beschikbare landbouwgrond en toenemende bevolking, zijn onderzoekers over de hele wereld uitgedaagd met dringende behoeften voor verbetering gewas. De opbrengst kan sterk worden beïnvloed door verschillende biotische en abiotische stress. Onder hen, pathogeeninfectie is een van de belangrijkste oorzaken van gewasopbrengst verminderen, verantwoordelijk voor ongeveer 12% verlies in de VS alleen 45. Om dit probleem op te lossen, heeft enorme onderzoek gedaan in het model Arabidopsis – P. syrin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
