Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
In Abwesenheit von spezialisierten mobilen Immunzellen, Pflanzen nutzen ihre lokalisierten programmierten Zelltod und Systemische Akquirierte Resistenz, sich gegen Pathogenbefall verteidigen. Der Beitrag einer speziellen Arabidopsis Gens an der Gesamtanlage Immunantwort spezifisch und quantitativ durch Bestimmung des Wachstum des Pathogens im infizierten Gewebe bewertet. Seit über drei Jahrzehnten, die hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) wurde weithin als Modell Erreger, die molekularen Mechanismen der Arabidopsis Immunantwort zugrunde liegenden Untersuchung angewendet. Um Krankheitserreger in das Blattgewebe zu liefern, haben mehrfache Impfung Verfahren festgelegt, beispielsweise Spritzen Infiltration, dip Inokulation, Spray, Vakuuminfiltration, und Hochwasser Inokulation. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Spritze Infiltrationsverfahren zu virulenten Psm ES4326 in Blätter von erwachsenen liefernBodenkultur Arabidopsis-Pflanzen und genau Bildschirm für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegenüber diesem Erreger. Zusätzlich kann dieses Protokoll mit mehreren Vorbehandlungen, ergänzt werden, um spezifische Immundefekten weiter zerlegen innerhalb unterschiedlicher Schichten des pflanzlichen Abwehr einschließlich Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) und MAMP-Triggered Immunity (MTI).
Introduction
Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien 1 bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen 1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung 2. Um sich gegen diese Mikroorganismen wirksam zu verteidigen, haben Pflanzen einen komplizierten angeborenen Immunsystems mit mehreren Überwachungsmechanismen ausgestattet, um den Erreger Angriff zu erkennen und auslösen entwickelt lokalisiert programmierten Zelltod 3 sowie Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung der wesentlichen sig konzentriertnaling Komponenten und Quer Gespräche innerhalb der Anlage Immunsystem 5.
Wie in der "Zig-Zag" Modell 5 vorgeschlagen, die erste Schicht der Anlage angeborenen Immunantwort erfordert die Anwesenheit von Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), um die Invasion einer Mikrobe zu erkennen. PRRs können Microbe-associated molecular patterns (mAmps) zu erkennen und zu etablieren MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Neben Induktion eines Transkriptions-Hochregulierung von Genen antimikrobielle PR-Proteinen 7 kodiert, führt MTI auf eine Vielzahl von Ereignissen, die das Wachstum des Pathogens, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Abscheiden Callose an die Zellwand zu verhaften sowie die Aktivierung von mehreren Kinase Signalwege 8.
Bis jetzt wurden mehrere MAMPS identifiziert MTI in Arabidopsis auslösen, einschließlich bakterieller flg22 9 </sup> (Ein 22 Aminosäurefragment von Flagellin abgeleitet) elf18 10 (18 Aminosäuren aus dem bakteriellen Elongationsfaktor Tu Übersetzung) und einem strukturellen Zellwandkomponente Peptidoglykane 11. Um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren, haben einige spezielle Krankheitserreger die Möglichkeit, geheime Virulenz Effektor-Proteine in die intrazelluläre oder interzellulären Räumen entwickelt und damit zu unter MTI und lösen Effektor-Triggered Anfälligkeit (ETS) 12,13. Zum Beispiel können die Virulenz Effektoren Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierungskaskaden MTI zu inaktivieren, um die Entwicklung der Erkrankung in dem infizierten Gewebe 14-16 induzieren. Während der dynamischen Koevolution zwischen Hosts und Krankheitserreger, Pflanzen entwickelte auch die Gegenstrategie, die Effektor-Proteine erkennen und dämpfen das Pathogen Virulenz Moleküle 17. Diese direkte oder indirekte Effektor Erkennung durch Krankheitsresistenz (R) 18-Proteine vermittelt wird. Meiste tSaum sind Mitglieder der NB-LRR (Nukleotid-Bindungs und Leucin-reichen Wiederholungen) Familie 19. Die Wahrnehmung eines avirulenten Effektorzellen durch ein R-Protein löst eine stärkere und breitere Immunantwort charakterisiert als Effektor-Triggered Immunity (ETI) 20. Neben der Induktion der Expression von Abwehrgene 21 und die Produktion von Verteidigungsmetaboliten 22, ETI führt oft zu einer raschen lokalisierten programmierten Zelltod als hypersensible Reaktion (HR) bekannt, die Pathogen-Ausbreitung in das benachbarte Gewebe 3 zu beschränken.
Neben der lokalisierten programmierten Zelltods 23, sind Pflanzen der Lage, eine langfristige und systemweiten Immunantwort bezeichnet Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Bei Provokation mit einem biotrophe Erreger, Pflanzenzellen auszulösen, die Biosynthese und Akkumulation eines endogenen Phytohormon Salicylsäure (SA) und PR-Proteinen sowohl in lokalen und systemischen Geweben 24. Durch tsein Verfahren ein gesteigertes Zustand der Bereitschaft in den nicht-infizierten Blättern, die für die Montage schneller Abwehrreaktionen bei einer nachfolgenden Infektion durch ein breites Spektrum von Erregern 24 ermöglicht erreicht. SA und ihre synthetischen Analoga, wie Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl ester (BTH) und 2,6-Dichlorisonicotinsäure (INA) in der Lage sind, chemisch zu induzieren Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) bei der externen Anwendung 24. Nonexpressor der Pathogenese-Assoziierte Gene 1 (NPR1) wird vorgeschlagen, einer der SA-Rezeptoren und wirkt als Haupttranskriptionsregulator während SA-vermittelte Abwehrreaktion sowohl in lokalen und systemischen Geweben 21,25,26 sein. Es hat sich eindeutig gezeigt, dass NPR1 für SAR Einrichtung erforderlich ist, und der Verlust von NPR1 führt zu dramatischen Anfälligkeit gegenüber Pseudomonas syringae 25.
Um umfassend charakterisieren die molekularen Beitrag der PflanzenKomponenten in den Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, mehrere Biotests wurden entwickelt, um spezifische Abwehr Veranstaltungen zu messen, einschließlich ROS Burst 27, Kallose-Abscheidung 28, Verteidigung Gene Expression und Anhäufung von ihrer Proteinprodukte 21. Während diese Einzeltests können Einblicke in eine spezifische Form der Pflanze Immunantwort bereitzustellen, keiner von ihnen ist jedoch in der Lage sind, das komplette Abwehrreaktion an der gesamten Pflanze Ebene darstellen. Umgekehrt ist die Quantifizierung der Pathogen Wachstum nach der Infektion bietet eine Gesamtschätzung der Immunantwort auf der organismischen Ebene. Daher ist die Entwicklung und Optimierung von einem präzisen und hoch standardisierte Erreger Inokulation Assay kritischen Kraftstoff den Forschungen und Entdeckungen auf den Arabidopsis Immunantworten.
Pseudomonas syringae, ein Gram-negatives Bakterium, wurde als Phytopathogen Lage verursacht Krankheit in einem Bereich von Wirten, einschließlich Pflanzen Arabidops identifiziertenist 29. Als Modellpflanze-Pathogen-System, das Arabidopsis – P. syringae Interaktion wurde in großem Umfang angewendet, um die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Pflanzenabwehrreaktionen 29 zu verstehen. Bisher über 50 P. syringae Pathovare wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Pflanzenarten infizieren 30 identifizierten . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 und P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sind die beiden am weitesten verbreitete und umfassend charakterisiert virulenten Stämmen. Abgesehen davon, dass durch die Pflanze erkannt und Auslösen des MTI Reaktion Pst DC3000 und PSM ES4326 sind zur Sekretion virulenten Effektorproteine MTI drücken und lösen ETS, das Wachstum des Pathogens 31,33 begünstigen.
Funktionell sezieren die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae, multiple0; Pathogeninfektion Methoden wurden auf der Grundlage des Erregers Liefer Ansatz entwickelt. Für Bodenkultur Pflanzen, können Krankheitserreger mit einer Spritze Infiltration, Vakuuminfiltration, Tauch Inokulation und Sprühinokulation 29,34 geliefert werden. Vor kurzem wurde Sämling Flut Inokulation Assay entwickelt, um große Bildschirme auf Gewebekulturplatten durchführen wachsenen jungen Arabidopsis-Pflanzen 35. Syringe Infiltration, als einer der am häufigsten verwendeten Ansatz, manuell liefert die Erreger in den Apoplasten durch die natürlichen Blattöffnungen bezeichnet Spaltöffnungen 29. Durch diesen Ansatz, gleiche Mengen von P. syringae in die befallenen Blatt infiltriert werden und die Stärke der pflanzlichen Immunantwort ist umgekehrt an die das Wachstum des Pathogens Niveaus korreliert. Daher dient die Quantifizierung der Pathogen Wachstum als eine optimale Vorgehensweise, um die Immunfunktion im gesamten Werksebene zu bewerten. Darüber hinaus können Spritzen Infiltration der lokalen und systemischen Gewebe zu unterscheiden, worin B kanne in der Charakterisierung der molekularen Mechanismen SAR 36 erhoben.
In dem folgenden Protokoll beschreiben wir eine optimierte Spritze Infiltration Assay mit Psm ES4326 um Arabidopsis-Mutanten für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) zu screenen. Dieses Protokoll wird zwei Arabidopsis-Genotypen zu beschäftigen: ein Wildtyp-Ökotyp Columbia-0 (Col-0), Pflanzen (Kontrolle) und npr1-1 loss-of-function-Mutanten (hypersusceptible) das wird mit virulenten Bakterienstamm Psm ES4326 37 infiziert werden. Die npr1-1 Mutante trägt eine Punktmutation in der Ankyrin-Repeat-Consensussequenz des NPR1 Molekül, das die hoch konservierten Histidin zu Tyrosin verändert und macht das Protein nicht-funktionellen 25. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Modifikationen der Spritze Infiltration Assay beschrieben, die die Quantifizierung von Fehlern in den spezifischen Schichten aus Immunantwort, einschließlich MTI und STI ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit abnehmender verfügbaren Ackerland und wachsende Bevölkerung, sind die Forscher auf der ganzen Welt mit der dringendsten Bedürfnisse für die Verbesserung von Kulturpflanzen in Frage gestellt. Die Ausbeute kann stark durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren beeinflusst werden. Unter ihnen ist Pathogeninfektion eine der führenden Ursachen für Ernteertragsreduktion, für ca. 12% Verluste allein in den USA 45 verantwortlich. Um dieses Problem zu beheben, hat massive Forschung im Modell …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
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