Bakteriell Leaf Infiltration analys för Fine karakterisering av växt Defense Svar använder<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
I avsaknad av specialiserade mobila immunceller, växter utnyttja sin lokaliserade programmerad celldöd och systemisk förvärvad resistens för att försvara sig mot patogen attack. Bidraget från en specifik Arabidopsis gen till hela anläggningen immunsvaret kan vara specifikt och kvantitativt genom att analysera patogenen tillväxt inom den infekterade vävnaden. För mer än tre decennier, har hemibiotrophic bakterien Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) i stor utsträckning som modell patogen för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom Arabidopsis immunsvaret. Att leverera patogener in i bladvävnaden, har flera ympning metoder fastställts, t.ex. sprut infiltration, dopp ympning, spray, vakuuminfiltrering och översvämningar ympning. Följande protokoll beskriver en optimerad spruta infiltration metod för att leverera virulent PSM ES4326 i blad av vuxnajord-odlade Arabidopsis växter och exakt skärmen för ökad känslighet sjukdom (EDS) mot denna patogen. Dessutom kan detta protokoll kompletteras med flera förbehandlingar för att ytterligare dissekera specifika immundefekter inom olika skikt av växters försvar, inklusive Salicylsyra (SA) -Triggered Immunitet (STI) och MAMP-Triggered Immunitet (MTI).
Introduction
På grund av sin fastsittande naturen, växter hotas ständigt av en uppsjö av patogener som uppvisar olika livsstilar och närings strategier 1. Till en första approximation, biotrophic patogener behålla sin värd levande att hämta näring, medan necrotrophic patogener aktivt hemliga toxiner och enzymer för att döda värdvävnad och foder på de döda cellerna 1. En annan grupp av patogener, benämnda hemibiotrophs börjar sin infektion kursen med biotrophic scenen och skiftar till necrotrophic scenen när den når en viss tröskel av patogen ackumulering 2. För att på ett effektivt sätt försvara sig mot dessa mikroorganismer har växter utvecklats ett komplicerat medfödda immunsystemet utrustad med övervakningsmekanismer flera att detektera patogener attack och utlösa lokaliserad programmerad celldöd 3 samt systemisk förvärvad resistens (SAR) 4. Pågående forskning är inriktad på att karakterisera det väsentliga signaling komponenter och kors samtalen inom anläggningen immunsystemet 5.
Såsom föreslås i "sicksack" modell 5, det första skiktet av anläggningen medfödda immunsvar kräver närvaro av plasmamembran-lokaliserad Pattern Recognition receptorer (PRRs) för att detektera invasionen av en mikrob. PRRs kan känna igen Mikrobliknande Associated Molecular mönster (mAmps) och etablera MAMP-utlöst Immunity (MTI) 6. Förutom att inducera en transkriptionell uppreglering av gener som kodar för antimikrobiella PR-proteiner 7, leder MTI till en mängd olika händelser som gripa patogen tillväxt, inklusive produktion av reaktiva syreradikaler (ROS) och reaktivt kväve Arter (RNS), avsättning av callose till cellväggen samt aktivering av multipla kinassignalvägar 8.
Hittills har flera mAmps identifierats att utlösa MTI i Arabidopsis, innefattande bakteriella flg22 9 </sup> (En 22 aminosyrafragment härlett från flagellin), elf18 10 (18 aminosyror från den bakteriella översättnings elongeringsfaktor Tu) och en strukturell cellväggskomponent peptidoglykaner 11. Att etablera en framgångsrik infektion har vissa specialiserade patogener utvecklats förmågan att hemliga virulens effektor proteiner i de intracellulära eller intercellulära utrymmena, och därmed undertrycka MTI och utlösa Effector-utlöst känslighet (ETS) 12,13. Till exempel kan virulensegenskaper effektorer inaktivera mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) fosforyleringsställen kaskader av MTI att inducera utveckling sjukdomen inom den infekterade vävnaden 14-16. Under den dynamiska samevolution mellan värdar och patogener, växter också utvecklat motattack strategi att erkänna effektorproteiner och dämpa patogenen virulens molekylerna 17. Denna direkta eller indirekta effektor erkännande förmedlas av motstånds sjukdom (R) proteiner 18. De flesta av them är medlemmar i NB-LRR (binding och leucinrika upprepning) familje 19. Upplevelsen av ett avirulent effektor av en R-proteinet framkallar ett starkare och bredare immunsvar karakteriseras som Effector-Triggered Immunity (ETI) 20. Förutom att inducera uttrycket av försvarsgener 21 och produktionen av försvars metaboliter 22, leder ETI ofta till en snabb lokal programmerad celldöd som kallas överkänslig svar (HR) för att begränsa patogenen sprids till intilliggande vävnad 3.
Förutom det lokaliserade programmerad celldöd 23, växter är i stånd att initiera en långsiktig och systemövergripande immunsvar benämns Systemisk förvärvad resistens (SAR) 4. Vid utmaning med en biotrophic patogen, växtceller utlösa biosyntes och ackumulering av en endogen fytohormonerna salicylsyra (SA) och PR-proteiner i både lokala och systemiska vävnader 24. Genom thans process, är en förhöjd beredskap uppnåtts i de oinfekterade bladen som möjliggör montering snabbare svar försvars under en efterföljande infektion av ett brett spektrum av patogener 24. SA och dess syntetiska analoger såsom benso- (1,2,3) -thiadiazole-7-karbotiosyra S -metylestern (BTH) och 2,6-dichloroisonicotinic syra (INA) är i stånd att kemiskt inducera Salicylsyra (SA) -Triggered Immunitet (STI) vid externa program 24. Nonexpressor av patogenes relaterade gener 1 (NPR1) föreslås bli en av SA-receptorer och fungerar som en stor transkriptionsregulator under SA-medierad försvarssvar i både lokala och systemiska vävnader 21,25,26. Det har slutgiltigt visat att NPR1 krävs för SAR etablering och förlusten av NPR1 leder till dramatiska känslighet mot Pseudomonas syringae 25.
Att i stor utsträckning karakterisera den molekylära bidrag anläggningkomponenter i växt patogen interaktioner, har flera bioanalyser tagits fram för att mäta de specifika försvars händelser, inklusive ROS brast 27 callose avsättning 28, försvarsgener uttryck och ackumulering av deras proteinprodukter 21. Även om dessa enskilda analyser kan ge insikter i en särskild form av anläggningen immunsvar, ingen av dem, dock kan representera hela försvars svar på hela anläggningsnivå. Omvänt, kvantifiering av patogener tillväxt efter infektion ger en övergripande bedömning av immunsvar på organismnivå. Därför är avgörande för att driva upp forskning och upptäckter på Arabidopsis immunsvar för utveckling och optimering av en exakt och mycket standardiserade patogen ympning analys.
Pseudomonas syringae, en gramnegativ bakterie, identifierades som en phytopathogen förmåga att orsaka sjukdom i ett intervall av växtvärdar inklusive Arabidopsär 29. Som modellväxten-patogen systemet, Arabidopsis – P. syringae interaktion har i stor utsträckning för att förstå de molekylära mekanismerna bakom växters försvar svar 29. Hittills över 50 P. syringae pathovars har identifierats baserat på deras förmåga att infektera olika växtarter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 och P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 är de två mest använda och i stor utsträckning kännetecknade virulenta stammar. Bortsett från att erkännas av anläggningen och utlöser MTI svar, Pst DC3000 och PSM ES4326 är kapabla att utsöndra virulenta effektorproteiner att undertrycka MTI och utlösa ETS att gynna patogenen tillväxt 31,33.
Funktionellt dissekera samspelet mellan Arabidopsis och P. syringae, flertal0; patogeninfektion metoder har utvecklats baserat på patogen leveranstillvägagångssättet. För jordodlade växter, kan patogen levereras med spruta infiltration, vakuuminfiltrering, dopp ympning och sprut ympning 29,34. Nyligen var plantöversvämnings ympning analys utvecklad för att utföra storskaliga skärmar på vävnadsodlingsplattor odlade unga Arabidopsis växter 35. Spruta infiltrering, såsom en av de mest använda tillvägagångssättet, ger patogenen till apoplasten genom de naturliga bladöppningarna benämnda klyvöppningar 29 manuellt. Genom detta tillvägagångssätt, lika stora mängder av P. syringae kan infiltreras i den infekterade blad och styrkan i anläggningen immunsvar är omvänt korrelerad till patogen tillväxtnivåer. Därför kvantifiering av patogener tillväxt fungerar som en optimal strategi för att utvärdera immunförsvaret på hela fabriksnivå. Dessutom kan spruta infiltration skilja lokala och systemiska vävnad, som kan be tillämplig i karakterisera de molekylära mekanismerna bakom SAR 36.
I följande protokoll, beskriver vi en optimerad spruta infiltration analys med PSM ES4326 att screena Arabidopsis mutanter för ökad mottaglighet sjukdom (EDS). Detta protokoll kommer att sysselsätta två Arabidopsis genotyper: en vild-typ ekotypen Columbia-0 (Col-0) växter (kontroll) och npr1-1 förlust-of-funktion mutanter (hypersusceptible) som kommer att vara smittade med virulent bakteriestam PSM ES4326 37. Den npr1-1 mutant bär en punktmutation i ankyrin-repeat konsensussekvensen av NPR1 molekylen, som ändrar den mycket konserverade histidin till tyrosin och gör proteinet icke-funktionell 25. Dessutom är ett antal ändringar i sprutan infiltration analysen beskriven som tillåter kvantifiering av defekter i de särskilda lagren av immunsvar, inklusive MTI och STI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med minskande tillgänglig jordbruksmark och ökande befolkning, forskare runt om i världen utmanas med trängande behov av gröda förbättring. Utbytet kan i hög grad påverkas av olika biotisk och abiotisk stress. Bland dem är patogeninfektion en av de främsta orsakerna till minskningen avkastning, som ansvarar för ungefär 12% förluster i USA enbart 45. För att lösa det här problemet, har massiv forskning bedrivits i modellen Arabidopsis – P. syringae pathosystem att övergripande karakt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
