In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
במהלך התפתחות עוברית, רקמה ואיבר המורפוגנזה תתקיים באמצעות תכנית מדויקת שיכול להיות מתוארת במונחים של התפשטות תאים, נדידת תאים ומפרט שושלת 1-4. תהליכים ביולוגיים אלה מעורבים גם בשמירה על הומאוסטזיס רקמה בוגרת, אשר דורש התחדשות תאי גזע. מעקב שושלת, זיהוי והמעקב של הצאצאים של סוג מסוים של אוכלוסיית תאים, מספק כלי חשוב ללימוד עובר ונובע הומאוסטזיס תא. ואכן, הוא משמש יותר ויותר בתחומים רבים של מחקר. במיוחד, מעקב שושלת הפך כלי חיוני בזיהוי המקור וגורלם של תאי גזע בפיתוח הומאוסטזיס והסרטן. סיבה לכך הוא שהוא עשוי לספק מידע חיוני על איך התא מתנהג בהקשר של הרקמה או אורגניזם שלמים, עם התערבות מינימאלית ניסיונית, בניגוד לבידוד תא ובתרבות או transplantati מבחנהשבעלול לגרום להטיה לא רצויה.
באופן מסורתי, צבעים כגון carbocyanine שומנים מסיסים, אשר משלבים לתוך קרום הפלזמה של תאים, שמשו למעקב שושלת. למרות שהסוגים אלה של ניסויים הובילו בהצלחה לתגליות גדולות ומושגים מכוננים בצורה בביולוגיה התפתחותית 5,6, יש להם כמה מגבלות, כולל הקושי לשלוט הספציפי של תאים ממוקדים, ההשפעה לא רצויה של הצבע על התנהגות תא והדילול של התווית לאורך זמן. גישות תיוג אנלוגי נוקלאוטיד אפשרו מתעדות את קיומה של איטי רכיבה על אופניים "תאי תווית שמירה" שככל הנראה מתאים לרגיעת תאי גזע 7,8. עם זאת, בעוד שטכניקה זו יכולה להפגין הנוכחות של תאי רכיבה איטיים המבוססים על קינטיקה התפשטות על פני תקופה זמן מוגבלת זה לא יכול לספק תובנות משמעותיות לגבי הפונקציונליות של תאי גזע. ספיד שושלת התחקות אופטימליodology צריך למזער את ההשפעה של תיוג על המאפיינים של התאים המסומנים, צאצאיו, או שכניו. בנוסף, זה יהיה מועיל יש שליטה על האינדוקציה התיוג, כלומר, יש את היכולת לתייג אוכלוסיית התא של עניין בשלב ואופן תלוי זמן, כמו גם בתא בודד אופן (משובט). שיטת תיוג יציבה ובלתי הפיכה שהוא עבר על כל הצאצאים של תא המייסד חשובה כל כך שהתווית תהיה נשמרת לאורך זמן, ולא הועברה לתאים שכנים.
לאחרונה, גישות גנטיות של תיוג תא פותחו. במערכות אלה, ניתן להשתמש במקדמים ספציפיים תא כדי לעורר ביטוי recombinase Cre כדי להסיר מחסום-וצד loxP ולאפשר את הביטוי של גני כתב כגון גני כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק או Β-galactosidase 9-13. גישה זו מאפשרת לא רק המעקב של תאים וצאצאיהם, אלא גם מאפשרת תא הואolation ואפיון מולקולרי. מעקב תא ברמת התא הבודד התאפשר על ידי אינדוקציה של הביטוי של גן כתב ניאון בודד. מגבלה חשובה אחת של מערכת זו היא העובדה שרק כאשר אחוז נמוך מאוד של תאים שכותרתו ניתן להפריד ולעקוב אחר שיבוטים בודדים. כדי להתגבר על מגבלה זו יכולים לשמש כתבי ססגוניות. בעת שימוש בתיוג ססגוניות, המעקב של גורל ההפרש של תאי שכנים באותו הנישה יכול להיות מושגת יעילות 14-17. לאחרונה, מגוון רחב של Brainbow אללים (Br) פותחו לניסויי שושלת התחקות, המאפשר ביטוי סטוכסטיים של גני כתב ניאון מרובים ניצול Cre / מערכת לקס. מערכת Cre / לקס מורכב של אנזים recombinase Cre, אשר מכיר ונקשר לרצפי DNA ספציפיים כגון אתרי loxP. בעקבות עקידת recombinase Cre, רקומבינציה הספציפית האתר מתרחשת, מה שגורמת לרצפי הסרת loxP המוקף resultinG בביטוי אקראי של חלבוני ניאון שונים (המנגנון מתואר להלן). מגוון רחב של קווי Br זמין לשימוש (ראה ביקורות 16,18,19). ההבדלים העיקריים בין זני Br כוללים הבדלים (i) במספר גני ניאון הכלול בקלטת, שנעו בין 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) גני ניאון , (Ii) את נוכחותם של אתרי לקס חוקיים הדדי לאפשר היפוך גן (Br2.0-2.1), (iii) הסוג של אתרי לקס משמשים, וכן (iv) הביטוי או שתיקתו של ביטוי גני ניאון לפני הפעלת Cre. Br3 הוקם לאחרונה מציע שיטה משופרת להדמיה ססגוניות של נוירונים. אחד המאפיינים העיקריים של התמליל הזה הוא שהוא מכיל סט חדש של חלבוני photostable farnesylated ניאון, המאפשרים גם צביעה העצבית הטוב ביותר מעבד 20.
חשוב לציין, גרסאות שונות של קלטות Br עשויות להכיל ספציפיות העצבי Thy1 יחסי ציבורomoter או בכל מקום הביע CAG אמרגן (CMV). לבסוף, בזמן שחלק מהעכברים הטרנסגניים Br עשוי להכיל transgene Br בודד, אחרים יכולים להיות מורכבים ממספר רב של עותקי transgene, ובכך מאפשרים הייצור של מספר עצום של אפשרויות לשילובי צבעים לבוא לידי ביטוי בכל תא (למשל לראות 16).
במחקר שלנו, השתמשנו בעכבר R26R-קונפטי המכיל את קלטת Br 2.1 21. Br2.1 הוא בעיצוב ייחודי כדי לאפשר היפוכי DNA בתיווך Cre ולא רק השמטות בגלל הנטייה ההדדית של אתרי loxP (איור 1). לפיכך, אירועי היפוך / כריתה אלה שיובילו לשינוי צבע יכולים להמשיך כל עוד Cre קיים 16. מסיבה זו, מערכת ביטוי מושרה זמנית Cre היא חיונית למעקב תא אמין באמצעות Br2.1. כפי שניתן לראות באיור. 1, Br2.1 מכיל אמרגן CAG בכל מקום ואחרי -casse ניאו-R מוקף loxPטטי, אשר משמש כמחסום תעתיק, שאחריו 4 גני ניאון כתב, קידוד לירוק (GFP), צהובים (YFP), אדום (RFP) וציאן (CFP) חלבוני ניאון, ממוקמים בשני tandems. אין הקרינה באה לידי ביטוי לפני הפעלת Cre. אינדוקציה של recombinase Cre גורמת להסרת של קלטת ניאו-R המאפשרת ביטוי האקראי של אחד 4 חלבוני ניאון בתא נתון. הקטע הראשון מכיל GFP-מוקף loxP וYFP הפוך, ואילו המגזר השני מכיל RFP-מוקף loxP וCFP הפוך. מגזרי DNA אלה עשויים להיות הפוכים ברציפות (באמצעות loxP שהוא בכיוון הפוך), או נכרת, כל עוד recombinase Cre הוא הווה. לכן, יש להשתמש transgene Cre חולף ובשליטה. קלטת Br2.1 מספקת מערכת מצוינת להבחנה בין פליטות חופפות למיקום אות: הביטוי של YFP וRFP הוא cytoplasmic, GFP הוא גרעיני וCFP חייב קרום התא. GFPופליטת RFP מופרדות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי. על מנת להפריד את פליטת YFP / GFP / CFP, יש צורך במערכת ההדמיה confocal רפאים. בסך הכל, את קלטת Br2.1 מאפשרת ביטוי הספציפי האקראי, מושרה, ורקמות של אחד מכל ארבעה גני ניאון שונים בכל תא ממוקד. למעשה, כאשר יש צורך במספר גדול יותר של שילובי צבעים, אחד יכול ליצור עכברים הומוזיגוטים המכילים 2 אללים של Br2.1, ובכך וכתוצאה מכך הביטוי של 2 תגי צבע לכל תא ובהעלאת מספר שילובי צבעים אפשריים עד 10 22. חלק מזני עכבר Br לאפשר הביטוי של מספר גדול בהרבה של שילובי צבעים אפשריים מאז מספר עותקים של הקלטת שולבו הגנום שלהם 16. עם זאת, ברוב המקרים, ארבעת שילובי צבעים הניתנים על ידי אלל Br2.1 אחת מספיקים. בעקבות הפרוטוקול ניתן כאן, אפשר להקים בשיטה זו משתמשת בהתקנה פשוטה יחסית של spectrמיקרוסקופיה אל עם מעט אם בכלל צורך בכיול.
כאן אנו מספקים פרוטוקול להתאמה לשימוש בעכברי R26R-קונפטי המכילים אלל Br2.1 יחיד, לניסויי שושלת התחקות של האפיתל קרני. זן עכבר מהונדס זו שימש ללימוד ולגורלו של מעי גס 21,23 ותאי גזע אפיתל קרני 22,24, הנוכחות של פעילות תאי גזע בסרטן המעי גס 25, ולאפיון podocyte כליות בפקעיות הכליה מגזרית מוקד (FSGS) 17.
ניסויי שושלת התחקות נערכו במשך שנים רבות. השיפורים הטכנולוגיים האחרונים והופעתה של זני עכבר קונפטי פתחו אפיקים חדשים למחקר. היום, חוקרים יכולים ליהנות ממספר רב של קווים זמינים מסחרי רקמות ספציפיות Cre, עכברי נוקאאוט ועכברים מהונדסים. זה מספק הזדמנות לעיצוב מערכות תכליתית ניסיוניות לטיפול בשאלות מדעיות עם מומחיות בסיסית, הימנעות בפועל מייגע, תוך מתן נתונים חזקים ואמינים.
עכברי R26R-קונפטי הם כלי אלגנטי למעקב יעיל ולומד את הטבע והתנהגותם של תאים בגוף חי. המערכת קלה להקמה והיא מאפשרת מעקב שושלת לא פולשנית של תאים בודדים בעובר, נובעת התחדשות תאים תחת הומאוסטזיס, או בנסיבות שונות כגון פציעה, דלקת וסרטן. נתונים הזמינים מספק descript חזקיון של ההישרדות של תאים ממוקדים, הרחבת תא משובט ונדידת תאים, באופן לכימות. שלב קריטי יהיה לבחור את זן העכבר הגנטי המתאים שיכול באופן מהימן מאפשר תיוג רקמות ספציפי יעילים בשלב ההתפתחותי מדויק. מגבלה אחת של מערכת זו היא כי לניטור אורגניזם חי, הרקמה חייבת להיות נגישה ושקופה. כמו כן, מעקב רקמה עבה בתוך החי ניתן הקל רק על ידי שני פוטונים או במיקרוסקופ רב-פוטונים. עם זאת, מעקב תא אפשרי בסעיפי רקמות שלאחר המוות ואולי הרקמה שלמה ניתן ללמוד לאחר שהפך להיות שקוף בשיטת CLARITY 32,33. מגבלה נוספת שיש להתחשב היא שלמרות שתאים סמוכים המבטאים את אותו fluorophore סביר שייכים לאותו שושלת משובט, אפשר גם שהם עלולים להיות מופקים ממקור תאים עצמאי שאופן אקראי הביע אותו גן הניאון. possibili זהטאי הופך להיות מאוד לא סביר בעת שימוש באללים Br מרובים כדי לאפשר שילובי צבעים רבים.
בעתיד, המשלב את מערכת קונפטי עם כלים גנטיים זמינים (כלומר, נוקאאוט, מודלים עכבר להתרפק ומהונדסים) יאפשר המחקר של גנים והמוטציות שלהם בבריאות ופתולוגיה. כמו כן, שושלת התחקות תחת הפרעות מערכת שונות (כלומר, נובע נישה תא הרס, אבלציה תא לייזר בתיווך, טיפול תרופתי) תביא תובנות חדשות על מעורבותם של מסלולי איתות בהחלטות גורל תא. סופו של דבר, השימוש קומבינטורית של תיוג ניאון ופליטת אור, כתבים גנטיים של מסלולי איתות וחיתוך מיקרוסקופיה קצה יספק לחוקרי מערכת חזקה כדי ללמוד כיצד אחד תאים מגיבים לסביבתם בסביבה הטבעית שלהם.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |