We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Phospholipider er de vigtigste bestanddele af cellemembraner og membraner af organeller, og fluiditeten af disse membranlag ofte påvirker cellulære funktioner ved at ændre aktiviteten af membranproteiner 1 – 3. For eksempel, membran lipid homeostase opnås ved at regulere membranfluiditet, som detekteres af membranproteiner og et unormalt niveau af flydende forårsager alvorlige sygdomme, såsom hepatisk steatose og cholestasis 4. Hertil kommer, flydende en phospholipid monolag ved luft-alveolerne væske grænsefladen har vigtige implikationer i sine funktioner. Høj fluiditet lungesurfactant phospholipid monolag letter spredning af laget under inhalation, mens en lav fluiditet giver laget at holde sig inden alveolerne under udånding 5,6. Det er derfor vigtigt at vurdere fluiditet af phospholipidet lag for at forstå deres roller.
_content "> et direkte mål for fluiditeten er viskositet, og viskositeten af phospholipid lag er blevet målt ved hjælp af mikrometerstore kolloider 7, magnetiske nåle 8,9 og knapper mikromagnetiske 6,10,11. Men disse teknikker er begrænset til relativt stive film, og kan ikke måle mindre viskøse film. For sådanne tilfælde vil diffusivitet være et alternativ til at kvantificere fluiditet phospholipid lag. For flere årtier, har en række teknikker til måling af diffusionsegenskaber phospholipid lag blevet udviklet, såsom fluorescens quenching metode 12, pulseret feltgradient NMR 13 og fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) 14. En af de mest repræsentative metoder er fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) 15,16. På grund af enkelheden af målingen og beslægtede teorier, flere undersøgelser af diffusion egenskaber phospholipid lag er blevet udført ved hjælp af FRAP <sup> 17 – 19. Men FRAP kræver normalt en dyr konfokal mikroskop setup med en kraftig laser.Her præsenterer vi en ny teknik til at måle den laterale diffusion af phospholipid monolag, betegnes som fluorescens bedring efter sammenlægning (FRAM). Den afgørende forskel mellem FRAP og FRAM er, at fotoblegning trin erstattes af drop sammensmeltning. Fletning en dråbe dækket af ikke-fluorescens monolag på en fluorescens-mærket flad monolag efterlader en cirkulær mørk plet på en lys flad monolag, og dermed oprette den samme oprindelige tilstand med fotoblegning trin. Vi derefter observere fluorescens opsving i mørke pletten med tid til at måle den laterale diffusivitet. Denne nye "blegning" trin drop sammensmeltning giver betydelige fordele i forhold til FRAP: FRAM kræver kun et fluorescensmikroskop snarere end et dyrt konfokalt mikroskop med en stærk laser, der er nødvendig for FRAP. Jegn Derudover FRAM har et bredt udvalg af fluorescens farvestoffer, da det ikke involverer fotoblegning processen. Endelig er de to forskellige monolag, en dråbe monolag og en flad monolag, kan fremstilles uafhængigt af hinanden, således at interdiffusion, der skal måles, mens FRAP kun måler selv-diffusion af monolag.
FRAM tilbyder en bred vifte af diffusion målinger fra højviskose materialer til næsten inviskos materialer. I princippet kan FRAM måle den maksimale diffusivitet af 10 6 um 2 / sek, som er sammenlignelig med eksisterende teknikker, når diffusion forekommer, gennem området 100 um med 100 um under tiden for dråbe sammensmeltning processen (~ 10 msek). Desuden langsom diffusionsproces kan let måles, medmindre monolag er faste. FRAM kan anvendes til alle former for overfladeaktive materialer, så længe passende fluorescens mærkede molekyler er til rådighed.
FRAM deler en masse af de grundlæggende principper med FRAP, især til måling af fluorescens bedring efter blegning et bestemt område, men FRAM bruger en proces for at fusionere en dråbe på den flade grænseflade til at danne en bleget område, i stedet for at anvende en intensiv lys. Sammenlægningen proces er derfor vigtigste skridt i FRAM og især, formen af den mørke plet på den flade monolag efter sammenlægning en dråbe bestemmer nøjagtigheden af diffusivitet måling. Specifikt baseret på en aktuel fremgangsmåde, vi kun indstille cirkel med en radius R som en region af interesse at beregne den gennemsnitlige intensitet af mørk plet, der er vist i procedure 4, og hvis der er en for stor afvigelse fra den cirkulære form, dette ville forstyrre den præcise måling af en diffusionskoefficient. Det er derfor nødvendigt at få et cirkulært formet mørk region, men Cd'er former dannes lejlighedsvis på grund af flere årsager. Først hvis der findes en konvektiv strømning i Petri skålen, formen af det mørke område bliver langstrakt langs strømningsretningen. Som nævnt i proceduren 1.3, et apparat kegleform hjælper til at undertrykke den konvektive strøm, og dette forlængelse ville blive minimeret. For det andet, hvis den spidse ende af kapillarrøret rører den flade grænseflade under en sammenlægning proces bliver mørkt område udformet med en række forskellige former, idet den kapillære ende afbryder sammenlægningsarbejdet. Ved at opnå en dråbe, der kun hængende fra slutningen af kapillarrøret, kan denne afbrydelse forhindres. Især en hydrofob behandling af kapillarrøret hjælper dråben til at sidde i slutningen af kapillarrøret. Derfor ovenstående problemer skyderier og ændringer giver os mulighed for at måle diffusionsegenskaber mere præcist.
Dette godt troubleshot proces gør det således muligt FRAM at have flere væsentlige fordele i forhold FRAP. Først FRAM kræver enklere udstyr i forhold til FRAP. For FRAM, er det tilstrækkeligt at bruge en simpel fluorescens mikroerklare, i stedet for et dyrt konfokalt mikroskop med en stærk laser, hvis bølgelængde skal matche med absorptionsspektret af farvestoffet. Desuden er det nødvendigt at anvende yderligere apparat til at justere størrelsen på bleget område i FRAP, mens FRAM kontrollerer størrelsen af området let ved at justere størrelsen af dråben, eller overfladen tryk ved dråben overfladen. For det andet, er det muligt at anvende forskellige arter af farvestoffer i FRAM. FRAP bruger kun farvestofmolekyler hvis blegning proces er meget hurtigere end diffusionsprocessen. Hvis der opstår diffusion af farvestofferne under blegning proces, er det svært at vurdere udbredelsen egenskaben præcist. Fram imidlertid ikke kræver en fremgangsmåde til blegning af farvestoffer, og dette muliggør således anvendelsen af forskellige typer af farvestoffer i fluorescensafbildning. Hertil kommer, at FRAP kræver yderligere højeffektlasere og filtersæt at ændre farvestof arter, mens det kun er nødvendigt at udskifte filtersættene i FRAM. EndeligDa monolagene på dråben overflade og den flade grænseflade kan dannes uafhængigt, hvilket muliggør studiet af inter-diffusion eller blanding mellem to forskellige lipidmonolag ved at sammenlægge A-type monolag til B-typen monolag, mens FRAP måler kun self-diffusion af et monolag.
På trods af disse fordele, kan processen med at sammenlægge en dråbe på en flad luft-vand-grænsefladen potentielt begrænse denne teknik på grund af flere problemer, der kan være af interesse, såsom et fladetryk misforhold mellem de to monolag, tidspunktet omfanget af de fusionerende proces og en forøgelse i overfladetryk af den flade monolag efter sammenlægning dråber. Disse spørgsmål er imidlertid ikke påvirker målingen diffusion væsentligt af følgende grunde. Først, selvom overfladen pres på de to forskellige monolag er meget forskellige, er en ligevægt proces afsluttet på et meget tidligt tidspunkt under inddrivelse proces. For eksempel, hvis than fladetryk af monolaget på overfladen dråber er højere end af monolaget på den flade air-vand-grænsefladen, det mørke område udvider indtil overfladen tryk ligevægt. Da denne proces er afsluttet inden for 10 msek, vil fladetrykket ækvilibreres før det påvirker diffusionsprocessen betydeligt. For det andet, hvis tiden omfanget af de fusionerende processen er hurtig nok, det ikke begrænser målingen diffusionen overhovedet. Heldigvis er en typisk sammensmeltningsproces også afsluttet inden for 10 msek. Endelig, multipel sammensmeltning af dråberne på den flade grænseflade øger ikke fladetrykket siden overfladearealet af truget er langt større end overfladearealet af dråben. Ifølge størrelser af truget og dråberne, beskrevet i protokollen, det areal pr molekyle øger mindre end 0,015% ved at sammenlægge en dråbe. Følgelig stigningen i fladetryk på grund af ændringen af areal pr molekyle er mindre end 0,1%, hvilket er negligible fordi det er meget mindre end den typiske fejl i fladetryk, som målt ved Wilhelmy plade tensiometer.
Sammenfattende vi indført en ny metode til at måle den laterale diffusion egenskab ved et phospholipid monolag ved at flette en dråbe monolag på den flade grænseflade. Denne teknik kræver forholdsvis enkelt udstyr og giver også mulighed for anvendelse af forskellige former for farvestof arter. Fram er altså potentielt anvendelig til diffusion måling af eventuelle overfladeaktive midler, herunder phospholipider, blokcopolymerer, proteiner og endda nanopartikler ved en fluid-fluid interface. Derudover forventer vi, at FRAM giver en ny måde at studere den inter-diffusion eller blanding mellem to forskellige overfladeaktive midler.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af KAIST-finansierede K-dalen RØD & B Projekt for 2014 og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |