Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.
उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) विकसित दुनिया में दृश्य हानि का एक प्रमुख कारण है। रोग केंद्रीय दृष्टि के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप मैक्युला बुलाया रेटिना के केंद्र के विनाश से ही प्रकट होता है। प्रारंभिक एएमडी जैसे भौगोलिक शोष (एएमडी सूखा) या neovascularisation (गीला एएमडी) के रूप में देर एएमडी पर प्रगति कर सकते हैं कि मुलायम drusen नामक छोटे, पीले रंग के घावों की उपस्थिति की विशेषता है। नैदानिक परिवर्तन अच्छी तरह से वर्णित हैं, और एएमडी जोखिम प्रदान करने पर आनुवांशिक प्रभाव की समझ कभी अधिक विस्तृत हो रही है हालांकि, प्रमुख प्रगति की कमी एक ऐसा क्षेत्र आनुवंशिक जोखिम के जैव रासायनिक परिणामों की समझ है। इस Bruch झिल्ली, रक्त की आपूर्ति से सामग्री का एक जैविक फिल्टर और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) सेल monolayer रहता है, जिस पर एक पाड़ के रूप में कार्य करता है कि एक बहुत पतली बाह्य मैट्रिक्स के जैव रसायन समझने में कठिनाइयों की वजह से है। Drusen चBruch झिल्ली और उनकी उपस्थिति के भीतर ORM RPE कोशिकाओं को पोषक तत्व प्रवाह बाधित। केवल अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत कैसे वास्तव में Bruch झिल्ली की प्रोटीन संरचना की जांच कर रही है, और से, शोधकर्ताओं drusen गठन, विकास एएमडी की और बाद में दृष्टि हानि को मजबूती जैव रासायनिक तंत्र को खंडित करने की उम्मीद कर सकते हैं। इस पत्र में यह नीचे की ओर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, और यह पहले से ही Bruch झिल्ली जैव रसायन की समझ कैसे बदल रहा है के उदाहरण प्रदान किया जा सकता है, ताकि पूरे Bruch झिल्ली, या बस मैक्युला क्षेत्र से या तो समृद्ध बनाने के लिए तरीके का विवरण।
नेत्र अनुसंधान में पोस्टमार्टम मानव नेत्र ऊतक के उपयोग के नेत्र रोग रोगजनन को समझने के लिए एक अमूल्य संसाधन है। मानव दाता आंखों के विश्लेषण से पश्चिमी दुनिया 1 में अंधापन का प्रमुख कारण है, जो उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी), underpinning तंत्र समझदार के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है। विश्व स्तर पर, एएमडी सभी अंधापन का लगभग 8.7% के लिए खातों और एक तेजी से उम्र बढ़ने की आबादी के साथ, यह केंद्रीय दृष्टि के नुकसान में 2020 2। एएमडी परिणामों से 196,000,000 लोगों को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी की है और रोगी स्वतंत्रता और जीवन की गुणवत्ता पर गहरा प्रभाव पड़ता है 3। प्रारंभिक एएमडी drusen के गठन की विशेषता है और यह (भी neovascular या 'गीला' एएमडी के रूप में करने के लिए कहा गया है) (कभी कभी 'सूखा' एएमडी के रूप में करने के लिए कहा गया है) भौगोलिक शोष, या choroidal neovascularization करने के लिए प्रगति कर सकते हैं। विरोधी वीईजीएफ़ Whilst इंजेक्शन स्थिर कर सकते हैं या neovascular एएमडी यह मैं में दृष्टि में सुधारउपचारात्मक नहीं है, और वर्तमान में, कोई इलाज भौगोलिक शोष के लिए मौजूद है।
कुछ आनुवंशिक वेरिएंट एएमडी जोखिम 4 को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि – 8, कम इन वेरिएंट एक जैव रासायनिक स्तर पर मैक्युला को प्रभावित कैसे के बारे में जाना जाता है। एएमडी रोगजनन में एक महत्वपूर्ण स्थल Bruch झिल्ली है। इस संरचना और विभिन्न अध्ययनों के भीतर Drusen रूप में और एएमडी 9 में Bruch झिल्ली के आसपास सक्रियण पूरक के सबूत प्रदान की है। Bruch झिल्ली रंजित से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं को अलग करती है कि बाह्य मैट्रिक्स की एक चादर है, और लगभग 4 माइक्रोन मोटी है। Bruch झिल्ली रंजितपटलकोशिका में विलीन हो जाती है, गवाक्षित केशिकाओं और इस के लिए बाहरी होता है कि रंजित की एक परत बड़ा रक्त वाहिकाओं 10 (चित्रा 1 ए) युक्त परतें हैं।
Bruch झिल्ली अतिरिक्त की एक pentilaminar चादर हैसेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), और इस पद्धति लाल रक्त कोशिकाओं से काफी हद तक decellularized और जो मुक्त है, (अब Bruch झिल्ली को समृद्ध करने के लिए कहा गया है) अंतर्निहित रंजितपटलकोशिका के ईसीएम के साथ-साथ, Bruch झिल्ली को अलग-थलग करने के लिए विवरण कैसे। समृद्ध Bruch झिल्ली तो पश्चिमी सोख्ता और ऊतक विज्ञान के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, आँख के मैक्युला क्षेत्र से पूरी तरह तोड़कर की झिल्ली को समृद्ध बनाने के लिए कार्यप्रणाली में वर्णित है, एएमडी के जैव रासायनिक पहलुओं की जांच कर उन लोगों के लिए विशेष रुचि का हो जाएगा।
यहाँ हम आगे के विश्लेषण के पश्चिमी सोख्ता 11, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और उपयोग संशोधित कक्षों 11,14 ussing Bruch झिल्ली का प्रसार संपत्तियों सहित बाद के विश्लेषण की अनुमति के लिए Bruch झिल्ली के संवर्धन का वर्णन है। महत्वपूर्ण कदम एक) आंख के भीतरी सतह की पूरी तरह से स्क्रैप और वाशिंग तोड़कर के बिखर कारण के बिना सब RPE कोशिकाओं ख) अंतर्निहित रंजित के दोहराया और सावधान स्क्रैप को दूर करने और ultrapure पानी में excised तोड़कर के ग) धुलाई शामिल अवशिष्ट कोशिकाओं के सेल सुनिश्चित करने के लिए। समृद्ध Bruch झिल्ली प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा रहा है इसके अलावा, अगर, यूरिया उपचार द्वारा प्रोटीन निकासी ऐसी यांत्रिक एकरूपता के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में इस लचीला ऊतक को तोड़ने में सबसे प्रभावी है। समृद्ध Bruch झिल्ली के ऊतक विज्ञान रंजितपटलकोशिका के ईसीएम हटा नहीं है इंगित करता है। इस पूर्व होना हैpentilaminar Bruch झिल्ली की बाहरी परत के रूप में pected रंजितपटलकोशिका endothelial सेल तहखाने झिल्ली द्वारा बनाई है। वास्तव में यह परिवर्तन टर्मिनल पूरक जटिल / झिल्ली हमले परिसर (मैक) 15 के बयान सहित एएमडी में इस में होने के रूप में रंजितपटलकोशिका के ईसीएम बनी हुई है कि फायदेमंद हो सकता है। यह श्वेतपटल, रंजित, और Bruch झिल्ली की उपस्थिति में sectioned यदि Bruch झिल्ली की विस्तृत histological विश्लेषण के लिए, इसकी संरचना बेहतर संरक्षित किया जाएगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। दरअसल, चित्रा 2 में प्रस्तुत ऊतक विज्ञान केवल इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक से उत्पन्न संवर्धन की डिग्री को प्रदर्शित करने का इरादा है।
धब्बेदार तोड़कर के संवर्धन एनएसआर और विशेष रूप से गतिका क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने eyecup से सावधान विच्छेदन की आवश्यकता है; अन्यथा पहचान और मैक्युला के इस प्रकार अलगाव संभव नहीं हैं। tissu की अखंडताई भी इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और यह इसलिए 48 घंटा पोस्टमार्टम के समय के तहत नमूने का इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है। आवश्यक संवर्धन की डिग्री दाताओं के बीच होती है और दाता उम्र, पोस्टमार्टम के समय, और किसी भी आंख विकृति की उपस्थिति से प्रभावित हो सकते हैं। समृद्ध अवधि का उपयोग इस 'शुद्धि' या इस पद्धति का उपयोग Bruch झिल्ली की 'अलगाव' बस संभव नहीं है कि किया जा रहा है, तकनीक की एक सीमा को स्वीकार करने में जानबूझकर है। दरअसल, रंजितपटलकोशिका के ईसीएम Bruch झिल्ली में विलीन हो जाती है यह देखते हुए कि वहाँ पूरा जुदाई संभव नहीं है।
संबंधित नेत्र ऊतकों के जैव रासायनिक परिवर्तन को समझने नेत्र रोग प्रगति को समझने में आवश्यक है। Bruch झिल्ली का यह अनूठा संवर्धन इस समझ की सुविधा; चल रही पढ़ाई एएमडी के विभिन्न चरणों में मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग समृद्ध धब्बेदार Bruch झिल्ली के proteome जांच कर रहे हैंऔर अलग जीनोटाइप के साथ विषयों से होने वाले नमूनों में एएमडी की आणविक विकृति की समझ में सुधार करने के लिए। पहले से ही यहाँ वर्णित तकनीक को सफलतापूर्वक समृद्ध Bruch झिल्ली पर Bruch झिल्ली 11 और आगे की पढ़ाई में प्रमुख पूरक नियामक के रूप में FHL -1 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एएमडी की आणविक पैथोलॉजी में और अधिक नए अंतर्दृष्टि में परिणाम की संभावना है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ इसहाक Zambrano और मानव दाता आंख ऊतक की आपूर्ति के लिए मैनचेस्टर नेत्र अस्पताल नेत्र बैंक में कर्मचारियों, और एच एंड ई दाग छवियों के लिए जीवन विज्ञान प्रोटोकॉल सुविधा के संकाय के श्री पीट वाकर स्वीकार करना चाहते हैं। विशेष धन्यवाद माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए श्री रोजर मीडोज के लिए चला जाता है। एसजेसी एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद के एक प्राप्तकर्ता (एमआरसी) कैरियर विकास फैलोशिप (एमआर / K024418 / 1) है और लेखकों को भी, एमआरसी (G0900538 और K004441) से अन्य हाल के शोध से धन स्वीकार करते नजर में (1866) और धब्बेदार सोसायटी के लिए लड़ो।
Auxillary objective 0.5x | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
Biopsy Punch 6mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
Bovine serum albumin | Sigma – Aldrich | A3059 | |
Bromophenol Blue | Sigma – Aldrich | B0126 | |
Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma – Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
(A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100mm) and straight |
(B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample |
(C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
Glycerol | Sigma – Aldrich | G1345 | |
Glycine | Sigma – Aldrich | B0126 | |
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
Methanol | Sigma – Aldrich | M/4000/17 | |
Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90mm, used as a dish for samples |
Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T3253 |