Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
संवहनी पौधे संयंत्र के ऊतकों और बाहरी वातावरण के बीच निविड़ अंधकार बाधाओं के रूप में कार्य करते हैं कि बाह्य परतों पर भरोसा करते हैं। ये lipophilic सेल की दीवार से जुड़े संरचनाओं रोगजनक संक्रमण को प्रतिबंधित करने और में और संयंत्र के ऊतकों 1 से बाहर गैसों, पानी, और भंग पदार्थों के निष्क्रिय परिवहन को विनियमित। इस तरह की बाधाओं संयंत्र छल्ली, पौधों 2, और विभिन्न suberin युक्त प्रसार बाधाओं का एक अनोखा synapomorphic संरचना रहे हैं। छल्ली कोशिका दीवार 3-5 के बाह्य पक्ष पर एक pectinaceous परत के माध्यम से एपिडर्मल कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित और उन्हें करने के लिए बाध्य एक oleophilic परत है। यह संयंत्र के ऊतकों और पर्यावरण के बीच एक महत्वपूर्ण इंटरफेस के रूप में कार्य कर रहा है, उच्च पौधों की प्राथमिक हवाई अंगों encases।
Cutin, छल्ली की संरचनात्मक मैट्रिक्स, और suberin विलायक निष्कर्षण मोम 2,4 के साथ जुड़े दो अघुलनशील Glycerolipid पॉलिस्टर्स हैं। ये polymeric एलipids संतृप्त और असंतृप्त वसा अम्ल डेरिवेटिव से बना है और दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से समान हैं। हालांकि, वे रासायनिक संरचना और बयान साइटों में विशेषता मतभेद से अलग पहचाना जाता है।
Suberin एक माध्यमिक दीवार बनाने के लिए कुछ बाहरी और आंतरिक ऊतकों की कोशिका दीवारों के अंदर स्थित एक स्निग्ध पॉलिएस्टर है। Suberized ऊतकों जड़ों की periderms, कंद और पेड़ की छाल, जड़ अंस्त्वच, बीज कोट परतें, और चंगा घाव 2 शामिल हैं। Cutin के विपरीत, suberin पॉलिएस्टर आम तौर पर एल्कोहल, संतृप्त और मोनो असंतृप्त dicarboxylic एसिड, और बहुत-लंबी श्रृंखला मोनोमर्स का एक बड़ा हिस्सा (C≥20) शामिल हैं।
Cutin संवहनी पौधे 6 में सबसे प्रचुर मात्रा में लिपिड पॉलिएस्टर है, और ग्लिसरॉल और ऐसे हाइड्रोक्सी और हाइड्रोक्सी epoxy प्रतिस्थापित फैटी एसिड के रूप में 4 C16-C18 interesterified फैटी एसिड डेरिवेटिव, से बना है। Cutin पॉलिमर की रचना करते समय0, 18-हाइड्रोक्सी 9,10-epoxy: 18: 0, और 18 9,10,18-trihydroxy: 0 फैटी एसिड tracheophyte प्रजातियों भर में बदलता है, सबसे प्रमुख प्राथमिक मोनोमर्स 16 16-dihydroxy, 10 हैं। 2 dicarboxylic एसिड 7.8: दिलचस्प है, एराबिडोप्सिस पत्ती और cutin स्टेम मुख्य रूप से 18 से बना है।
संयंत्र cuticles भी कई माइक्रोमीटर से 9 तक कुछ नैनोमीटर से लेकर मोटाई में काफी परिवर्तनशीलता प्रस्तुत करते हैं। छल्ली अलगाव विशेष रूप से इस तरह के Arabidopsis thaliana 8 में से उन लोगों के रूप में बहुत पतली पत्ती cuticles के लिए एक श्रमसाध्य और समय लेने कदम है, के बाद से, छल्ली अलगाव को बायपास करने वाले तरीकों का विकास और 7.8 मान्य किया गया है। यहाँ, हम सोडियम methoxide (NaOMe) -catalyzed depolymerization और बाद गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) के विश्लेषण के द्वारा Arabidopsis thaliana पत्तियों में cutin की मोनोमर संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल सह परख करने की क्रिया के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करता हैपूरे delipidated ऊतकों में संयंत्र लिपिड पॉलिस्टर्स MPOSITION, और पहले से सूचना दी प्रोटोकॉल 7,10,11 से अनुकूलित किया गया है। पूरे ऊतक के नमूने हैं homogenized पहली और विस्तृत रूप से चर्म संबंधी और epicuticular वैक्स, झिल्ली लिपिड, और triacylglycerols सहित विलायक निष्कर्षण लिपिड को हटाने, delipidated। सेल की दीवार समृद्ध अवशेषों तो सोडियम methoxide उत्प्रेरित methanolysis द्वारा उनके घटक मिथाइल एस्टर मोनोमर्स में depolymerized कर रहे हैं। फैटी एसिड मिथाइल एस्टर अम्लीकरण पर निकाली गई, और उनके इसी trimethylsilyl या एसिटाइल डेरिवेटिव प्राप्त करने के लिए derivatized कर रहे हैं। Derivatized अवशेषों अत्यधिक अस्थिर कर रहे हैं, और जीसी / एमएस विश्लेषण के दौरान उनकी संरचनात्मक रचना बदलने के बिना एक उचित तापमान पर एक गैस क्रोमैटोग्राफी स्तंभ से eluted जा सकता है।
इस तरह के डीएनए और प्रोटीन के रूप में अन्य biopolymers के विपरीत, संयंत्र लिपिड पॉलिस्टर्स एक टेम्पलेट से नहीं बने हैं। इसके बजाय, उनकी रचनाओं इन बाह्य पॉलिमर बनाने कि ऊतकों में मौजूद एंजाइम की विशिष्टता पर निर्भर करते हैं। इस तरह, रासायनिक घटक के विश्लेषण के रूप में घटकों लिपिड पॉलिएस्टर संरचना को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
एस्टर बांड फोड़ना रासायनिक विधियों साबुन बनाने का काम, hydrogenolysis, एसिड उत्प्रेरित transmethylation, और आधार उत्प्रेरित transmethylation 2 शामिल हैं। उनमें से प्रत्येक फायदे और नुकसान है। साबुन बनाने का काम माध्यमिक प्रतिक्रियाओं से गुजरना कर सकते हैं कि मुक्त फैटी हाइड्रोक्सी एसिड पैदा करता है। लिथियम एल्यूमीनियम हाइड्राइड साथ Hydrogenolysis (LiAlH 4) 16 cutin विश्लेषण 7 के लिए इस्तेमाल किया गया है। Hydrogenolysis एल्कोहल को क्रियाशील कार्बन कम करता है और मूल संरचनाओं लिथियम एल्यूमीनियम deuteride (LiAlD 4) के साथ deuteriolysis से अनुमान लगाया जा करने की जरूरत है।इस दृष्टिकोण का नुकसान उनके ढांचे का कार्य करने के लिए प्राप्त फैटी polyols के deuteriation की डिग्री की तुलना करने के लिए उच्च संकल्प जीसी / एमएस की आवश्यकता है। Methanolic बोरान trifluoride (बीएफ 3) के साथ एसिड उत्प्रेरित transesterification अक्सर cutin और suberin depolymerizations 8,17,18 में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन अभिकर्मक एक सीमित शैल्फ जीवन है और प्रतिक्रियाओं 15 पक्ष की वजह से कलाकृतियों को पेश हो सकता। Methanolic सल्फ्यूरिक एसिड भी अन्य तरीकों 10 की तुलना में, मोनोमर्स की लेकिन शायद सच लिपिड पॉलिएस्टर घटक नहीं हैं, जो 2-हाइड्रोक्सी फैटी एसिड का बड़ा अनुपात, साथ मिथाइल एस्टर अर्जित करता है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित NaOMe उत्प्रेरित transesterification विधि पहचान के लिए विशेषता जन स्पेक्ट्रा प्रदान करने, हाइड्रॉक्सिल समूहों के silylation द्वारा derivatized कर रहे हैं कि फैटी एसिड मिथाइल एस्टर पैदा करता है, या एसिटिलीकरण द्वारा लिए हाइड्रॉक्सिल समूहों के अधिक स्थिर डेरिवेटिव प्रदान करने के लिएआर मात्रा। इस तकनीक का एक दोष यह है कि पानी की प्रतिक्रिया में मौजूद है जब हाइड्रोलिसिस transesterification के साथ प्रतिस्पर्धा है। जल NaOMe (उत्प्रेरक) के साथ प्रतिक्रिया करता है और बदले में मुक्त एसिड (चित्रा 2 डी) उपज के लिए फैटी एसिड मिथाइल एस्टर hydrolyses जो NaOH, पैदा करता है। इस प्रकार के विश्लेषण उलझी एक मिथाइल एस्टर और एक TMSI एस्टर व्युत्पन्न: दो चोटियों प्रत्येक फैटी एसिड के लिए उपस्थित होना होगा क्योंकि यह एक अवांछनीय पक्ष की प्रतिक्रिया है। निर्जल अभिकर्मकों का उपयोग और साबुन बनाने का काम के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए एक सह विलायक के रूप में मिथाइल एसीटेट जोड़ने हाइड्रोलिसिस (चित्रा 2 डी) को रोकने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं।
Cutin और suberin 1 और 26% ग्लिसरॉल 4 के बीच होते हैं। हालांकि, इस मोनोमर इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों से पता नहीं होगा। ग्लिसरॉल फैटी एसिड मिथाइल एस्टर मोनोमर्स के विपरीत, जलीय विलायक वाशिंग चरणों के दौरान ही समाप्त हो जाएगी, अत्यधिक हाइड्रोफिलिक है और। इस सीमा को भी एकअन्य cutin depolymerization तरीकों, लेकिन ग्लिसरॉल को pplies एक enzymatic विधि का उपयोग transesterification के बाद प्राप्त जलीय परत में निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यह मामूली शर्तों का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए।, 0.05 एम NaOMe) आगे पानी निकासी के बिना सभी मोनोमर्स पता लगाने के लिए, ग्लिसरॉल मात्रा का ठहराव के प्रयोजन के लिए .Although उपयोगी ग्लिसरॉल 19,20 सहित हल्के शर्तों आमतौर पर cutin की अधूरी depolymerization देने के लिए और suberin।
एक लौ आयनीकरण डिटेक्टर (खूंटी) के लिए मिलकर एक जीसी उपलब्ध है, तो एक प्रतिनिधि नमूने की चोटियों जीसी / एमएस द्वारा पहचान की गई है, के बाद सभी प्रतिकृति, मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए इस यंत्र में विश्लेषण किया जा सकता है। उनके बनाए रखने के सूचकांकों में जाना जाता है, तो वैकल्पिक रूप से, जीसी / खूंटी निशान में मोनोमर्स पहचाना जा सकता है। लौ आयनीकरण डिटेक्टर बड़ी और छोटी नमूना घटकों की मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है, जो विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता और समानता का एक व्यापक रेंज है,एकल रन में। इसके अलावा, यह मजबूत करने और बनाए रखने और 15 आसान काम है।
वर्णित प्रोटोकॉल एक या एक से अधिक लिपिड पॉलिएस्टर मोनोमर्स की संरचना में अलग है कि म्यूटेंट के रासायनिक लक्षण वर्णन अनुमति देता है, संयंत्र लिपिड पॉलिएस्टर monomers के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत अलगाव, पहचान, और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। प्रक्रिया यह आसानी से जड़ें, बीज, पत्ते, तने और फूल सहित विभिन्न संयंत्र सामग्री के छोटे और थोक दोनों मात्रा पर कार्रवाई करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता, स्केलेबल है। कई प्रजातियों से लिपिड पॉलिएस्टर monomers के मास वर्णक्रमीय डेटा, 21-26। उदाहरण के लिए प्रकाशित और अन्य ऊतकों और / या प्रजातियों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल ढालने जब अज्ञात मोनोमर्स की पहचान के लिए बहुमूल्य संसाधनों का गठन कर दिया गया है। इस विधि उच्च पौधों में लिपिड पॉलिस्टर्स जैवसंश्लेषण, विनियमन, और वितरण की जांच के लिए लागू है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |