Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Kärlväxter beroende av extracellulära skikt som fungerar som vattentäta barriärer mellan växtvävnader och den yttre miljön. Dessa lipofila cellväggsassocierade strukturer begränsar patogena infektioner och reglera passiv transport av gaser, vatten och lösta ämnen i och ut ur växtvävnader 1. Sådana hinder är Kutikula, en synapomorphic struktur unik för växter 2, och olika suberin innehåller diffusionsbarriärer. Nagelbanden är en oleofil skikt syntetiseras genom epidermala celler och bundet till dem via ett pektinhaltigt skikt på den extracellulära sidan av cellväggen 3-5. Det omsluter de primära flygbilder organ högre växter, fungerar som en viktig förbindelselänk mellan växtvävnader och miljö.
Inkoppling, strukturmatrisen av nagelband, och suberin är två olösliga glycerolipid polyestrar i samband med lösningsmedelsutvinnings växer 2,4. Dessa polymera lipids består av mättade och omättade fettsyraderivat och är både strukturellt och funktionellt likartade. Men de kan särskiljas genom karakteristiska skillnader i kemisk sammansättning och deponeringsplatser.
Suberin är en alifatisk polyester ligger innanför cellväggarna i vissa yttre och inre vävnader som bildar en sekundär vägg. Korkaktiga vävnader inkluderar periderms av rötter, stammar och bark, rot endodermis, fröskal skikt, och läkta sår 2. Till skillnad kutin, innehåller suberin polyestern typiskt alkoholer, mättade och mono-omättade dikarboxylsyror, och en stor andel av mycket-långkedjiga monomerer (C≥20).
Inkoppling är den vanligast förekommande lipiden polyester i kärlväxter 6, och består av glycerol och C16-C18 interesterifierade fettsyraderivat, såsom hydroxi och hydroxi-epoxi substituerade fettsyror 4. Även sammansättningen av inkopplings polymerervarierar mellan tracheophyte arter, de mest dominerande primära monomerer är 10, 16-dihydroxi 16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxi 18: 0 och 9,10,18-trihydroxi 18: 0 fettsyror. Intressant Arabidopsis blad och stam kutin består huvudsakligen av 18: 2 dikarboxylsyra 7,8.
Växtnagelband presenterar också en betydande variation i tjocklek, som sträcker sig från några få nanometer till flera mikrometer 9. Eftersom nagelband isolering är en mödosam och tidskrävande steg, i synnerhet för mycket tunna bladnagelband, såsom de från Arabidopsis thaliana 8 har metoder som kringgår ytterhud isolering utvecklats och validerats 7,8. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att studera monomerkompositionen av kutin i Arabidopsis thaliana blad med natriummetoxid (NaOMe) -catalyzed depolymerisation och efterföljande gaskromatografi / masspektrometri (GC / MS) analys. Detta protokoll har en robust metod för att analysera comställning av växt lipid polyestrar i hela delipiderade vävnader, och har anpassats från tidigare rapporterade protokoll 7,10,11. Hela vävnadsprover är första homogeniseras och uttömmande delipiderade, ta bort lösningsmedelsutdragbara lipider inklusive cuticular och epicuticular växer, membranlipider och triacylglyceroler. Cellvägg berikade rester sedan depolymeriseras i sina ingående metyl estermonomerer av natriummetoxid katalyserade metanolys. Fettsyrametylestrar extraheras vid surgöring, och derivatiserad för erhållande av deras motsvarande trimetylsilyl eller acetylderivat. Derivatiserade rester är mycket flyktigt, och kan elueras från en gas-kromatografikolonn vid en rimlig temperatur utan att deras strukturella konforma under GC / MS-analys.
Till skillnad från andra biopolymerer såsom DNA och proteiner, är växt lipid polyestrar inte görs från en mall. Istället deras kompositioner beror på specificiteten av de enzymer som förekommer i vävnaderna som gör dessa extracellulära polymerer. Som sådan, kemiska analyser av de ingående komponenterna är viktigt att förstå lipid polyesterkomposition.
Kemiska metoder för att klyva esterbindningar inkluderar förtvålning, hydrogenolys, syrakatalyserad transmetylering och baskatalyserad transmetyleringsaktivitet 2. Var och en av dem har sina fördelar och nackdelar. Förtvålning producerar fria fettsyror hydroxisyror som kan genomgå sekundära reaktioner. Hydrogenolys med litiumaluminiumhydrid (LiAlH4) 16 har använts för kutin analys 7. Hydrogenolys minskar funktionaliserade kol till alkoholer och de ursprungliga strukturerna måste sluta med deuteriolysis med litiumaluminiumhydrid deuteride (LiAlD 4). DeNackdelen med detta tillvägagångssätt är kravet på hög upplösning GC / MS för att jämföra graden av deuteriation av fett polyoler erhållna att göra tilldelningar av deras strukturer. Syrakatalyserad omförestring med metanolisk bortrifluorid (BF3) har ofta använts i kutin och suberin depolymerizations 8,17,18, men reagenset har en begränsad hållbarhet och kan införa artefakter på grund av sidoreaktioner 15. Metanol svavelsyra ger också metylestrar av monomererna men med större andelar av 2-hydroxifettsyror, som förmodligen inte är sant lipid polyesterkomponenter, jämfört med andra metoder 10.
Den NaOMe-katalyserad transförestring metod beskrivs i detta protokoll producerar fettsyrametylestrar som derivatiseras genom silylering av hydroxylgrupper, vilket ger karakteristiska Masspektra för identifiering, eller genom acetylering för att ge mer stabila derivat av hydroxylgrupper for kvantifiering. En nackdel med denna teknik är att hydrolys konkurrerar med omförestring när vatten är närvarande i reaktionen. Vatten reagerar med NaOMe (katalysatorn) och producerar NaOH, vilket i sin tur hydrolyserar fettsyrametylestrar för erhållande fria syror (figur 2D). Detta är en icke önskvärd sidoreaktion eftersom två toppar kommer att vara närvarande för varje fettsyra: en metylester och en TMSI esterderivat, vilket således komplicerar analysen. Med hjälp av vattenfria reagens och lägga metylacetat som ett samlösningsmedel för att konkurrera med förtvålning är således viktiga åtgärder för att förhindra hydrolys (figur 2D).
Kutin och suberin innehåller mellan 1 och 26% glycerol 4. Emellertid kommer denna monomer inte detekteras genom de experimentella förhållanden som beskrivs i detta protokoll. Glycerol är mycket hydrofila och, till skillnad från de fettsyrametylestrar monomerer, kommer att elimineras under de vattenhaltiga lösningsmedelstvättningssteg. Denna begränsning också enpplies till andra inkopplings depolymeriseringsprodukter metoder, men glycerol kan bestämmas i vattenskiktet erhölls efter transförestring med användning av en enzymatisk metod. Alternativt kan det kvantifieras med hjälp av mildare betingelser (t ex., 0,05 M NaOMe) utan ytterligare vattenuttag för att upptäcka alla monomerer, inklusive glycerol 19,20 .Även användbara för ändamålet av glycerol kvantifiering, milda förhållanden brukar ge ofullständig depolymerisation av kutin och suberin.
Om en GC kopplad till en flamjonisationsdetektor (FID) finns tillgänglig kan alla replikat analyseras i detta instrument för kvantitativa ändamål, efter toppar i ett representativt urval har identifierats av GC / MS. Alternativt kan monomerer i GC / FID spår identifieras om deras behålla index är kända. Flamjonisationsdetektorn har speciellt hög känslighet och ett brett spektrum av proportionalitet, som är kritisk för kvantifiering av större och mindre provkomponenteri enstaka körningar. Dessutom är det robust och enkel att underhålla och driva 15.
Det beskrivna protokollet möjliggör för tillförlitlig och reproducerbar isolering, identifiering och kvantifiering av växt lipid polyester monomerer, så att den kemiska karakteriseringen av mutanter som skiljer sig i kompositionen av en eller flera lipid-polyester monomerer. Proceduren är skalbar, det kan lätt anpassas för att behandla både små och stora kvantiteter av olika växtmaterial, inklusive rötter, frön, blad, stjälkar och blommor. Masspektraldata av lipid polyester monomerer från många arter har publicerats t.ex.., 21-26 och utgör värdefulla resurser för att identifiera okända monomerer vid anpassningen detta protokoll till andra vävnader och / eller arter. Denna metod är tillämplig på undersökningar av biosyntesen, reglering och distribution av lipid polyestrar i högre växter.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |