Primær Sertolicellene er nødvendig for å studere testikkel-immun privilegium, signaltransduksjon under betennelse eller infeksjon, og utnyttelse av deres immunbeskyttende egenskaper. Her beskriver vi et enzymbasert protokoll for isolering av høy-rene primære Sertoli-celler og celler fra rotte peritubular testiklene.
Testis, og i særdeleshet den mannlige kjønnsceller, utfordrer immunsystemet på en unik måte fordi differensiert sperm først vises ved pubertet – mer enn ti år etter etableringen av systemiske immuntoleranse. Spermatogenese celler uttrykker en rekke proteiner som kan bli sett på som er ikke-selv av immunsystemet. Testis må da være i stand til å etablere toleranse overfor disse neo-antigener på den ene side, men likevel være i stand til å beskytte seg mot infeksjoner og tumorutvikling på den annen side. Derfor testis er en av få immun privilegerte steder i kroppen som tåler fremmede antigener uten fremkaller en skadelig betennelsesimmunrespons. Sertoli-celler spiller en viktig rolle for opprettholdelse av denne immun privilegert miljø av testis og også forlenge overlevelse av cotransplanted celler i et fremmed miljø. Derfor primære Sertolicellene er et viktig verktøy for å studere immun privilegiet av testis som ikke kan være easily erstattet av etablerte cellelinjer eller andre cellemodeller. Her presenterer vi en detaljert og omfattende protokoll for isolering av Sertoli celler – og peritubular celler hvis ønskelig – fra rotte testes innenfor en enkelt dag.
Testiklene produsere mannlige kjønnsceller og kjønnshormoner, dvs. androgener. Det organ er sammensatt av to avdelinger. I interstitiell rommet, som representerer ca 10-12% av total testikkelvolum 1, steroidogenesis skjer innenfor Leydigcellene. Den rørformede rommet representerer om lag 60-80% av testikkelvolum 1 og inneholder kjønnsceller og to typer somatiske celler – peritubular celler og Sertoli celler. Testis er delt av bindevev septa inn 250-300 lobules, som hver inneholder 1-3 svært convoluted sædkanaler. Disse rørelementene er omgitt av en basalmembran, et ark av kollagen, og en rundtgående lag av peritubular-celler (figur 1A).
Den germinal epitel er plassert på den luminale siden av basalmembranen. Sertoli-celler er store langstrakte celler som strekker seg over hele germinal epitel fra basalmembranen til lumen. De er sterkt attverket til basalmembranen og danner en kontinuerlig cellestruktur gjennom basolaterale organisert tett veikryss som tetter Germinal epitel fra interstitium og representerer blod-testikkelbarrieren. Sertolicellene har fremtredende cytoplasmatiske prognoser og konsekvenser som gjør dem i stand til å komme inn i tett morfologisk og funksjonell kontakt med en artsspesifikk, men konstant antall kjønnsceller. Diploide germinal stamceller spre og differensiere til spermatogonier.
Under meiose I kortvarig tetraploide spermatocytter genereres som utvikler videre inn i fire haploide spermatider under meiose II. Alle kjønnsceller er sammenkoblet ved cytoplasmatiske broer, slik at de danner en celledelt nett. Den hoved hendelse i løpet av modningen av spermatider er ekstrudering av store deler av cytoplasmaet, danner rest-legemer, i en prosess som kalles spermiogenesen. Resterende kropper er phagocytosed av Sertolicellene. Sene spermatider blir deretter sluppet utde rørformede lumen og transporteres inn i bitestikkelen for videre modning. Sertoli celler og kjønnsceller synes å gjensidig koordinere spermatogenesis topografisk og funksjonelt.
Utarbeidelse av individuelle testikkelcelletyper startet nesten et århundre siden, da små testikler stykker ble dyrket og celletyper identifisert ved mikroskopi to. Ved forsiktig disseksjon av tubuli etter åpning av tunica albuginea å bruke fin-tipped tang var det senere mulig å skille rørformet og interstitiell avdelinger 3. I 1975 Welsh og Wiebe innført en kollagenase behandling for å frigjøre rørelementene fra å feste seg interstitielle vev og en pankreatin behandling for fjernelse av det ytre cellelaget peritubular 4. Fra tidlig på unge umodne rotter (ca. 20 dager gamle) ble brukt i hvilken Sertoli-cellene utgjør en stor del av den rørformede cellepopulasjon fordi spermatogenesen ikke har begynt enda. I denne alderen rotte SertOLI cellene slutter å dele seg, og tett veikryss mellom naboceller dannes slik at blod-testikkelbarrieren er etablert fem.
Uavhengig av walisisk og Wiebe Dorrington et al. Innført en kombinasjon av trypsin og deoksyribonuklease fulgt av soybeen trypsin inhibitor og collagenase behandling som ble utgitt samme år 6. Begge gruppene også brukes mekaniske kraft (tegning fordøyd rørformede fragmentene gjentatte ganger gjennom en sprøytenål eller en Pasteur pipette henholdsvis) for å fremstille en homogen cellesuspensjon for plettering som inneholder omtrent 70% Sertoli-celler. Etter 3 dager i kultur, ved hjelp av et medium som er serumfritt, øker prosentandelen av Sertoli-celler til omtrent 90%. Dette kan i stor grad tilskrives døden av forurensende kjønnsceller. Rester peritubular celler (PTCs), men holde fast festet via sin ekstracellulære matrise. PTCs, men ikke Sertoli-celler, er kjent for å produserefibronektin som kan tjene som en markør protein for å estimere forurensning med PTCs. Derfor Tung et al. begrunnet at en ytterligere hyaluronidase behandling kan forbedre renheten av Sertoli-cellefraksjonen 7. Faktisk kan de vise at en ytterligere behandling var i stand til å redusere forurensning av PTCs tilnærmet 20 ganger, noe som blir særlig tydelig når sammenlignet et serumholdig medium benyttes for dyrking av renset Sertoli-celler. Fra da av den forbedrede prosedyren for Tung et al. ble den rådende protokollen og er mye brukt av andre hovedgrupper i felt 8 (figur 1B).
Under kollagenase behandling flertallet av PTCs blir frigjort og kan isoleres i parallell med Sertoli-celler. Mens PTCs kraftig spre og ikke svare på follikkelstimulerende hormon (FSH), trenger Sertolicellene ikke gjennomgå mitose lenger og svare på FSH ved karakteristiske morfologiske endringerog en økning i (cAMP) konsentrasjon 9 cyklisk adenosinmonofosfat. Svært like enzymatiske fordøyelse protokoller kan anvendes for isolering av primære Sertoli-celler fra andre dyr, som menneske 10, mus 11,12, sibirsk hamster 13 eller 14 jak. For fjerning av store mengder forurensende bakterieceller en hypotonisk sjokk kan anvendes ved enden av isoleringsprosedyren 15. Dette gir også en effektiv isolering av Sertoli celler fra voksne rotte testiklene 16. En beriket Sertoli cellesuspensjon kan også skilles fra kjønnsceller ved plating suspensjonen på lektin retter belagt med Datura stramonium agglutinin 17. Bare Sertoli celler og noen få rest PTCs følge de lektin platene.
Primær Sertoli cellekulturer, hovedsakelig fra rotte, har vært brukt i første omgang for å undersøke respons på hormoner eller etablere cellelinjer som muse Sertoli celle line TM4 18. Denne cellelinjen har blitt undersøkt i mer enn hundre studier til i dag. I en translasjonell tilnærming Sertolicellene har blitt utnyttet for immuno-beskyttelse av co-dyrkede celler og vev som i co-transplantasjon av xeno- eller allogene bukspyttkjerteløyer for langsiktig pode overlevelse uten systemisk immunsuppresjon 19. Isolerte Sertoli celler er også brukt i co-kultur eksperimenter for å studere epiteliale-mesenchymale (Sertolicellene – PTCC) og somatisk-bakterie celle (Sertolicellene – kjønnsceller) interaksjoner 20, 21. Nylig primære Sertoli-celler er blitt anvendt for å undersøke ekspresjon av Toll-lignende reseptorer og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, så vel som signaloverførings kaskader som fører til cytokinproduksjon uttrykket etter infeksjon med ikke-patogen og uropathogenic E. coli 22. Andre nyere undersøkelser brukte Sertolicellene for å studere testikkelimmun privilege 23 og vist at testosteron forbehandling undertrykker LPS-indusert betennelsesreaksjon 24.
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Guido Verhoeven og Ludo Deboel, Leuven, som var svært nyttig i å etablere isolering av primær Sertoli celler i Meinhardt lab i Giessen. Monika Fijak, Gießen, er kjent for hennes hjelp med figur 1A og råd. Studiene ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft gjennom stipend BH 93 / 1-1 (SB) og finansiering av International Research Graduate College JLU Gießen (Tyskland) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Støtte ble også hentet fra et tilskudd av staten Hessen innenfor programmet "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) kalt "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |