عزل خلايا سيرتولي وPeritubular الخلايا من الفئران الخصية
Summary
يرجى ملء الخلايا الأولية لدراسة سيرتولي-الخصية المناعة امتياز، نقل الإشارة أثناء التهاب أو عدوى، والاستفادة من خصائصها immunoprotective. نحن هنا وصف بروتوكول القائم على انزيم لعزل خلايا سيرتولي الأساسي العالية النقاء والخلايا peritubular من الخصيتين الفئران.
Abstract
الخصية، وبخاصة في الأمشاج الذكور، يتحدى نظام المناعة في طريقة فريدة من نوعها لالحيوانات المنوية متباينة تظهر لأول مرة في مرحلة البلوغ – بعد أكثر من عشر سنوات على إنشاء التسامح المناعي النظامية. الخلايا المنوية تعبر عن عدد من البروتينات التي يمكن أن ينظر إليها على أنها غير المتمتعة بالحكم الذاتي من قبل النظام المناعي. يجب أن تكون الخصية ثم قادرا على إنشاء التسامح لهذه المستضدات الجدد من جهة ولكن لا يزال قادرا على حماية نفسه من العدوى والتنمية الورم من جهة أخرى. لذلك الخصية هي واحدة من عدد قليل من المواقع المتميزة المناعة في الجسم التي تحمل مستضدات أجنبية دون إثارة استجابة مناعية التهابات ضارة. خلايا سيرتولي تلعب دورا أساسيا في المحافظة على هذه البيئة المتميزة المناعة الخصية وأيضا تطيل بقاء الخلايا cotransplanted في بيئة أجنبية. لذلك خلايا سيرتولي الأساسية هي أداة هامة لدراسة الامتياز المناعة الخصية التي لا يمكن أن تكون هاستبدال asily من خطوط الخلايا أنشئت أو نماذج الخلوية الأخرى. هنا نقدم بروتوكول مفصل وشامل لعزل الخلايا سيرتولي – والخلايا peritubular إذا رغبت في ذلك – من الخصيتين الفئران في غضون يوم واحد.
Introduction
الخصيتين تنتج الأمشاج الذكرية والهرمونات الجنسية، أي الأندروجين. ويتكون الجهاز من قسمين. في حجرة الخلالي، التي تمثل حوالي 10-12٪ من إجمالي حجم الخصية 1، توليد الستيرويد يحدث داخل الخلايا ايديغ. تمثل مقصورة أنبوبي حول 60-80٪ من حجم الخصية (1) ويحتوي على خلايا الجرثومية ونوعين من الخلايا الجسدية – خلايا peritubular وخلايا سيرتولي. وينقسم الخصية بواسطة حواجز النسيج الضام إلى 250-300 الفصيصات، كل منها يحتوي على 1-3 الأنابيب المنوية الملتوية للغاية. ووضع هذه الأنابيب عن طريق الغشاء القاعدي، ورقة من الكولاجين، وطبقة كفافي الخلايا peritubular (الشكل 1A).
يقع ظهارة جرثومي على الجانب اللمعية من الغشاء القاعدي. خلايا سيرتولي هي الخلايا ممدود الكبيرة التي تمتد ظهارة جرثومي كاملة من الغشاء القاعدي إلى التجويف. هم بقوة توريآلم إلى الغشاء القاعدي وتشكيل ورقة الخلوية المستمر من خلال منعطفات ضيقة تنظيم basolateral حتى تسبب انسداد ظهارة جرثومي من الخلالي، ويمثل حاجز الدم في الخصية. خلايا سيرتولي لها إسقاطات وتداعيات التي تمكنهم من الحصول على اتصال المورفولوجية والوظيفية ضيق مع عدد أنواع محددة لكن المستمر للخلايا الجرثومية هيولي بارزة. مضاعفا الخلايا الجذعية جرثومي تتكاثر وتفرق في المني.
خلال الانقسام المنصف أنا باختصار عاش المنوية رباعي الصيغة الصبغية يتم إنشاؤها التي تنمي إلى أربع نطفة أرومية فرداني أثناء الانقسام الاختزالي الثاني. مترابطة جميع الخلايا الجرثومية التي كتبها الجسور هيولي بحيث تشكل شبكة الخلوي. الحدث الرئيسي خلال نضوج نطفة أرومية هو قذف أجزاء كبيرة من السيتوبلازم، وتشكيل الهيئات المتبقية، في عملية تسمى النطاف. والمبتلعة الهيئات المتبقية من الخلايا سيرتولي. ثم يتم الافراج نطفة أرومية في وقت متأخر إلىتجويف أنبوبي ونقلها إلى البربخ لمزيد من النضج. تظهر خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية لتنسيق الحيوانات المنوية متبادل الطوبوغرافي وظيفيا.
إعداد أنواع الخلايا الخصية الفردية بدأ منذ قرن تقريبا عندما تم الانتهاء من زراعة قطع الخصية الصغيرة وأنواع الخلايا التعرف بواسطة المجهر 2. عن طريق تشريح دقيق للالأنابيب بعد فتح الغلالة البيضاء الغلالة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس كان من الممكن في وقت لاحق لفصل أنبوبي ومقصورات الخلالي 3. في عام 1975 قدم ويلز وWiebe العلاج كولاجيناز من أجل تحرير الأنابيب من الانضمام النسيج الخلالي والعلاج البنكرياتين لإزالة الخارجية خلية طبقة peritubular 4. في وقت مبكر من على الفئران غير ناضجة الشباب (حوالي 20 يوما) استخدمت في والتي تتكون من خلايا سيرتولي جزء كبير من السكان خلية أنبوبي لأن الحيوانات المنوية لم تبدأ بعد. في هذا العصر الفئران سرتتتوقف خلايا اولى لتقسيم، وتشكل منعطفات ضيقة بين الخلايا المجاورة بحيث يتم إنشاء حاجز الدم في الخصية 5.
المستقلة الويلزية وWiebe Dorrington وآخرون. وعرض مجموعة من التربسين وديوكسي ريبونيوكلياز تليها المانع soybeen التربسين والعلاج كولاجيناز التي نشرت في نفس العام 6. يستخدم كلا الفريقين أيضا قوة ميكانيكية (رسم شظايا أنبوبي هضمها مرارا وتكرارا من خلال إبرة حقنة أو ماصة باستور على التوالي) من أجل إنتاج تعليق خلية متجانسة لطلاء يحتوي على ما يقرب من 70٪ خلايا سيرتولي. بعد 3 أيام في الثقافة، وذلك باستخدام وسيلة التي هي خالية من الدم، والنسبة المئوية للخلايا سيرتولي تزيد إلى ما يقرب من 90٪. ويمكن أن يعزى ذلك إلى حد كبير إلى وفاة تلويث الخلايا الجرثومية. خلايا peritubular المتبقية (PTCs)، ومع ذلك، يبقى بإحكام عبر مصفوفة من خارج الخلية. PTCs، ولكن ليس على الخلايا سيرتولي، ومن المعروف أن إنتاجفبرونيكتين التي يمكن أن تكون بمثابة البروتين علامة لتقدير التلوث مع PTCs. لذلك، تونغ وآخرون. معللا بأن العلاج هيالورونيداز إضافية قد تؤدي إلى تحسين نقاء الخلية جزء سيرتولي 7. في الواقع أنها يمكن أن تظهر أن علاج إضافي تمكنت من الحد من التلوث PTCs ما يقرب من 20 أضعاف، الذي يصبح واضحا بشكل خاص عند مقارنة يستخدم المتوسطة المحتوية على مصل لزراعة خلايا سيرتولي تنقيته. ومنذ ذلك الحين على إجراء تحسين تونغ وآخرون. أصبح بروتوكول السائد، وكان يستخدم على نطاق واسع من قبل المجموعات الرئيسية الأخرى في مجال 8 (الشكل 1B).
خلال فترة العلاج كولاجيناز يتم الافراج عن غالبية PTCs، ويمكن أن تكون معزولة بالتوازي مع خلايا سيرتولي. في حين أن PTCs تتكاثر بقوة ولا تستجيب لمنبه الجريب هرمون (FSH)، وخلايا سيرتولي لا تخضع الانقسام بعد الآن، ويستجيب لهرمون FSH من تغيرات شكلية مميزةوزيادة في أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) تركيز 9. تشبه بروتوكولات الهضم الأنزيمية يمكن أن تستخدم لعزل الخلايا سيرتولي الأولية من الحيوانات الأخرى مثل الرجل 10، والماوس 11،12، سيبيريا الهامستر 13 أو الياك 14. لإزالة كميات كبيرة من تلويث الخلايا الجرثومية صدمة ناقص التوتر يمكن استخدامها في نهاية إجراء العزل 15. وهذا يسمح أيضا عزل كفاءة الخلايا سيرتولي من الفئران الكبار الخصيتين 16. ويمكن أيضا تعليق خلية سيرتولي المخصب يمكن فصلها عن الخلايا الجرثومية التي طلي تعليق على أطباق كتين المغلفة مع جوز ماثل راصة 17. فقط خلايا سيرتولي وعدد قليل من PTCs المتبقية تلتزم لوحات كتين.
مزارع الخلايا الأولية سيرتولي، ومعظمهم من الفئران، وقد استخدمت في البداية عن التحقيق في الاستجابة للهرمونات أو إنشاء خطوط الخلايا مثل الخلايا لى الماوس سيرتوليشمال شرق TM4 18. وقد تم التحقيق هذا الخط خلية في أكثر من مائة الدراسات حتى اليوم. في نهج متعدية استخدمت خلايا سيرتولي لالمناعية حماية الخلايا والأنسجة كما في المشترك زرع الجزر البنكرياسية xeno- أو خيفي للبقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل المشترك مثقف دون كبت المناعة النظامية 19. وقد استخدمت خلايا سيرتولي معزولة أيضا في التجارب ثقافة مشتركة لدراسة الظهارية-الوسيطة (خلايا سيرتولي – PTCC) وخلية جسدية من الجراثيم (خلايا سيرتولي – خلايا الجرثومية) التفاعلات 20 و 21. وقد استخدمت خلايا سيرتولي الابتدائية مؤخرا للتحقيق في التعبير عن مستقبلات تول مثل وإفراز السيتوكينات proinflammatory فضلا عن شلالات نقل الإشارة مما يؤدي إلى خلوى التعبير بعد الإصابة ببكتريا غير ممرض وuropathogenic القولونية 22. تحقيقات أخرى الأخيرة كانوا يستخدمون خلايا سيرتولي لدراسة ص المناعة الخصيةrivilege 23 وأظهرت أن هرمون التستوستيرون ما قبل المعالجة يقمع استجابة الناجمة عن LPS التهابات 24.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر غيدو فرهوفن وودو Deboel، لوفين، الذين كانت مفيدة للغاية في إقامة عزل الخلايا سيرتولي الأولية في المختبر مينهاردت في جيسن. مونيكا Fijak، جن، اعترف لمساعدتها مع الرقم 1A والمشورة. تم دعم الدراسات التي الألمانية للبحوث من خلال منحة BH 93 / 1-1 (SB) وتمويل الدولي كلية بحوث الدراسات العليا JLU جيسن (ألمانيا) / جامعة موناش (ملبورن، أستراليا) GRK 1871 (SB). تم الحصول على دعم أيضا من منحة من الدولة هيسن ضمن برنامج "لاندز الهجومي زور ENTWICKLUNG Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) تسمى "Männliche Infertilität باي Infektion وEntzündung" (MIBIE).
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. . Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
