Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

Summary

Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.

Abstract

Der Hoden, insbesondere der männlichen Gameten, fordert das Immunsystem in einer einzigartigen Art und Weise, weil differenziert Spermien zuerst zum Zeitpunkt der Pubertät erscheinen – mehr als zehn Jahre nach der Gründung der systemischen Immuntoleranz. Spermatogenen Zellen exprimieren eine Reihe von Proteinen, die vom Immunsystem als nicht-selbst gesehen werden. Der Hoden muss dann in der Lage sein, Toleranz auf der einen Seite auf diese Neo-Antigene herzustellen, aber immer noch selbst zu schützen können vor Infektionen und Tumorentwicklung auf der anderen Seite. Daher ist die Hoden eines der wenigen Immun privilegierten Stellen im Körper, die ohne evozieren eine schädliche entzündliche Immunantwort fremde Antigene tolerieren. Sertoli-Zellen spielen eine Schlüsselrolle für die Pflege dieser Immun privilegierten Umgebung der Hoden und auch das Überleben von cotransplanted Zellen in einer fremden Umgebung zu verlängern. Daher Primär sind Sertoli-Zellen ein wichtiges Instrument für die Immunprivileg des Hodens studieren, die nicht E sein kannasily von etablierten Zelllinien oder andere zelluläre Modelle ersetzt. Hier präsentieren wir eine detaillierte und umfassende Protokoll zur Isolierung von Sertoli-Zellen – und peritubulären Zellen, falls gewünscht – von der Ratte Hoden innerhalb eines einzigen Tages.

Introduction

Hoden produzieren männlichen Gameten und Sexualhormone, also Androgene. Die Orgel ist aus zwei Kammern besteht. In den Zwischenraum repräsentiert, dass etwa 10-12% der gesamten Hoden ^{Band 1,} Steroidbildung findet innerhalb der Leydigzellen. Die röhrenförmige Kammer entspricht etwa 60-80% des Hodenvolumen ^{1 und} enthält Keimzellen und zwei Typen von somatischen Zellen – peritubulären Zellen und Sertoli-Zellen. Der Hoden wird durch Bindegewebssepten in 250-300 Läppchen unterteilt, die jeweils mit 1-3 stark gewundene Hodenkanälchen. Diese Röhren werden durch eine Basalmembran, ein Blatt von Kollagen eingeschlossen und einer umlaufenden Schicht aus peritubulären Zellen (1A).

Keimepithels auf der luminalen Seite der Basalmembran liegt. Sertoli-Zellen sind groß länglichen Zellen, die die gesamte Keimepithels von der Basalmembran zum Lumen erstrecken. Sie sind stark attschmerzte zu der Basalmembran und eine kontinuierliche Zell Blatt durch basolaterale organisiert tight junctions bilden, die das Keimepithel aus dem Interstitium verschließt und stellt die Blut-Hoden-Schranke. Sertoli-Zellen haben prominente zytoplasmatische Projektionen und Konsequenzen, die es ihnen ermöglichen, mit einer artspezifischen aber konstante Anzahl von Keimzellen in enge morphologische und funktionelle Verbindung zu setzen. Diploiden Keim Stammzellen vermehren und differenzieren sich in Spermatogonien.

Während der Meiose I kurzlebig tetraploiden Spermatozyten erzeugt werden, die wiederum in vier haploiden Spermatiden während der Meiose II entwickeln. Alle Keimzellen werden durch zytoplasmatische Brücken miteinander verbunden, so dass sie ein zellulares Netz bilden. Das Hauptereignis während der Reifung der Spermatiden ist die Extrusion von großen Teilen des Cytoplasmas, Bildung Restkörper in einem Verfahren Spermiogenese bezeichnet. Restkörper durch Sertoli Zellen phagozytiert. Später Spermatiden werden dann veröffentlicht inTubuluslumen und in den Nebenhoden zur weiteren Reifung gebracht. Spermatogenese topographisch und funktionell erscheinen Sertoli-Zellen und Keimzellen gegenseitig koordinieren.

Erstellung von individuellen Hodenzelltypen begann vor fast einem Jahrhundert als kleine Hodenstücke kultiviert wurden und Zelltypen durch Mikroskopie ² identifiziert. Durch sorgfältige Präparation der Röhrchen nach der Tunica albuginea Öffnung mit feinen bestückten Zange war es später möglich Rohr und interstitielle ^{Fächer 3} zu trennen. 1975 eingeführt Welsh und Wiebe eine Kollagenasebehandlung, um die Tubuli von anhaftenden Zwischengewebe und Pankreatin Behandlung zur Entfernung des äußeren peritubulären Zellschicht ⁴ zu befreien. Schon früh junge, unreife Ratten (ca. 20 Tage alt) hatte, in denen verwendet umfassen die Sertoli-Zellen einen großen Teil des rohrförmigen Zellpopulation weil Spermatogenese noch nicht begonnen hat. In diesem Alter Ratte SertOli Zellen aufhören zu unterteilen, und tight junctions zwischen benachbarten Zellen bilden, so daß die Blut-Hoden-Schranke ⁵ hergestellt ist.

Unabhängig von Welsh und Wiebe Dorrington et al. Führte eine Kombination von Trypsin und Desoxyribonuklase durch soybeen Trypsin-Inhibitor und Collagenase-Behandlung anschließen, die im selben Jahr ⁶ veröffentlicht wurde. Beide Gruppen auch mechanische Kraft (Zeichnung der verdauten Rohrbruchstücke immer wieder durch eine Spritzennadel oder einer Pasteur-Pipette jeweils), um eine homogene Zellsuspension für die Beschichtung zu erzeugen, enthält etwa 70% Sertoli-Zellen verwendet. Nach 3 Tagen in Kultur unter Verwendung eines Mediums, das serumfrei ist, erhöht sich der Anteil der Sertoli-Zellen auf etwa 90%. Dies könnte zum größten Teil auf den Tod zugeschrieben Keimzellen kontaminieren. Rest peritubulären Zellen (PTC), jedoch bleiben fest über ihre extrazelluläre Matrix gebunden. PTCs, aber nicht Sertoli-Zellen, sind dafür bekannt, zu produzierenFibronektin, die als Markerprotein für die Schätzung Kontamination mit PTCs dienen kann. Daher Tung et al. begründete, dass eine zusätzliche Hyaluronidase Behandlung kann die Reinheit des ^7-Fraktion Sertoli Zelle verbessern. Tatsächlich könnten sie zeigen, dass eine zusätzliche Behandlung zur Verringerung der Kontaminierung konnte durch PTCs etwa 20-fach, was besonders deutlich wird, wenn ein Vergleich in serumhaltigem Medium zur Kultivierung gereinigt Sertoli-Zellen verwendet wird. Von da an dem verbesserten Verfahren von Tung et al. wurde die vorherrschende Protokoll und wurde von anderen Hauptgruppen im Bereich ⁸ (1B) intensiv genutzt.

Während Kollagenasebehandlung die Mehrheit der PTCs freigegeben und kann parallel zu Sertoli-Zellen isoliert werden. Während energisch die PTCs vermehren und reagieren nicht auf Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Sertoli-Zellen durchlaufen nicht Mitose mehr und von charakteristischen morphologischen Veränderungen zu reagieren FSHund eine Zunahme in zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) -Konzentration ^9. Sehr ähnlich enzymatische Verdauung Protokolle können zur Isolierung von primären Sertoli-Zellen von anderen Tieren wie Menschen ^10, Maus ^11,12, Sibirische Hamster ^{13 oder} Yak ¹⁴ verwendet werden. Für die Entfernung von großen Mengen an Keimzellen einen hypotonischen Schock verunreinigen können am Ende des Isolierungsprozedur ¹⁵ verwendet werden. Dies ermöglicht auch die effiziente Isolierung von Sertoli-Zellen aus erwachsenen Ratte ¹⁶ Hoden. Ein angereichert Sertoli Zellsuspension kann auch mit Stechapfel Agglutinin ¹⁷ beschichtet durch Plattierung der Suspension auf Lektin Gerichte aus Keimzellen getrennt werden. Nur Sertoli-Zellen und ein paar Rest PTCs sich an die Lektin-Platten.

Primäre Sertoli-Zellkulturen, vor allem aus der Ratte, wurden ursprünglich für die Untersuchung von Reaktionsfähigkeit auf Hormone oder Festlegung Zelllinien wie die Maus Sertoli Zellen Li verwendetne TM4 ^18. Diese Zelllinie wurde in mehr als hundert Studien bis heute untersucht. In einem translationalen Ansatz haben Sertoli-Zellen wurden für Immunschutz von Co-kultivierten Zellen und Geweben, wie in der co-Transplantation von allogenen oder xeno- Pankreasinseln für langfristige Überleben des Transplantats ohne systemische Immunsuppression ¹⁹ verwendet. Und somatische Keimzelle (Sertoli cells – Keimzellen) -Wechselwirkungen ^{20, 21} – isoliert Sertoli-Zellen wurden auch in Co-Kultur-Experimente zur Untersuchung der epithelial-mesenchymalen (PTCC Sertoli-Zellen) verwendet. Kürzlich primären Sertoli-Zellen wurden zur Untersuchung der Expression von Toll-like-Rezeptoren und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie auch die Signalketten, die zu Cytokin-Expression nach Infektion mit nicht-pathogenen und uropathogene E. beschäftigt coli ^22. Andere neuere Untersuchungen wurden mit Sertoli-Zellen für Hodenimmun p Studiumrivilege ²³ und gezeigt, dass Testosteron-Vorbehandlung unterdrückt die LPS-induzierte Entzündungsreaktion ^24.

Protocol

1. Tierethikerklärung Hier beschriebenen Experimente wurden für die Pflege und Verwendung von Tieren zu Versuchszwecken nach den Richtlinien des Regierungspräsidiums Gießen, Deutschland, als die Kommune und bestätigen, um den deutschen Code of Practice durchgeführt (Berechtigungs Nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tiere Bereiten 1% Jod Alkohol durch Auflösen von 1 g Jod in 100 ml Ethanol. Bereiten 2x 500 ml Dulbecco&…

Representative Results

Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von ca. 12 x 10 7 Sertoli-Zellen aus 10 Ratte Hoden. SO 3 x 10 6 Zellen pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert, dass sechs bis sieben Platten mit 6 Vertiefungen für Experimente zur Verfügung stehen 7. Die Trypsin-DNase I-Verdau der wichtigste Schritt bei der Sertoli Zellisolierung ist. Wenn Verdauung an dieser Stelle zu weit voran, erhöht sich das Verhältnis von Keimzellen / Sertoli Zell…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.