Isolamento delle cellule di Sertoli e peritubulari cellule da Rat testicoli
Summary
pile Sertoli sono necessari per lo studio testicolo-immunitario privilegio, trasduzione del segnale durante l'infiammazione o infezione, e l'utilizzo delle loro proprietà immunoprotettivi. Qui si descrive un protocollo a base di enzimi per l'isolamento delle cellule di Sertoli primaria altamente purificate e cellule peritubulari da testicoli di ratto.
Abstract
Il testicolo, ed in particolare il gamete maschile, sfida il sistema immunitario in modo unico perché differenziato spermatozoi appaiono prima al momento della pubertà – più di dieci anni dopo l'istituzione della tolleranza immunitaria sistemica. cellule spermatogeniche esprimono un certo numero di proteine che possono essere visti come non-self dal sistema immunitario. Testicolo deve quindi essere in grado di stabilire tolleranza a questi neo-antigeni da un lato ma comunque in grado di proteggersi dalle infezioni e sviluppo tumorale dall'altro. Pertanto il testicolo è uno dei pochi siti privilegiati immunitarie del corpo che tollerano antigeni estranei senza evocare una risposta immunitaria infiammatoria dannosa. cellule di Sertoli svolgono un ruolo chiave per il mantenimento di questo ambiente privilegiato immunitario del testicolo e anche prolungare la sopravvivenza delle cellule cotransplanted in un ambiente straniero. Pertanto cellule di Sertoli primarie sono uno strumento importante per lo studio del privilegio immunitario del testicolo che non può essere postaasily sostituito da linee cellulari stabilizzate o altri modelli cellulari. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l'isolamento delle cellule di Sertoli – e le cellule peritubulari se lo si desidera – da testicoli di ratto in un solo giorno.
Introduction
Testicoli producono gameti maschili e ormoni sessuali, cioè, gli androgeni. L'organo è composto di due compartimenti. Nel vano interstiziale, che rappresenta circa il 10-12% del volume testicolare totale 1, steroidogenesi avviene all'interno delle cellule di Leydig. Il vano tubolare rappresenta circa il 60-80% del volume testicolare 1 e contiene le cellule germinali e due tipi di cellule somatiche – cellule peritubulari e cellule di Sertoli. Il testicolo è diviso da setti di tessuto connettivo in 250-300 lobuli, ciascuna contenente 1-3 altamente contorte tubuli seminiferi. Questi tubuli sono racchiusi da una membrana basale, un foglio di collagene, e uno strato circonferenziale di cellule peritubulari (Figura 1A).
L'epitelio germinale si trova sul lato luminale della membrana basale. cellule di Sertoli sono grandi cellule allungate che si estendono su tutta la epitelio germinale dalla membrana basale al lume. Sono fortemente attdoleva alla membrana basale e formare un foglio cellulare continuo attraverso basolaterale giunzioni strette organizzati che occlude l'epitelio germinale dall'interstizio e rappresenta la barriera emato-testicolare. cellule di Sertoli hanno proiezioni citoplasmatici di primo piano e ramificazioni che permettono loro di entrare in contatto morfologica e funzionale stretto con un numero di specie-specifica, ma costante di cellule germinali. Le cellule staminali germinali diploidi proliferano e si differenziano in spermatogoni.
Durante la meiosi I breve durata spermatociti tetraploide sono generate che si sviluppano ulteriormente in quattro spermatidi aploidi durante la meiosi II. Tutte le cellule germinali sono interconnesse da ponti citoplasmatici in modo da formare una rete cellulare. L'evento principale durante la maturazione di spermatidi è l'estrusione di gran parte del citoplasma, formando corpi residui, in un processo chiamato spermiogenesi. corpi residui vengono fagocitati dalle cellule del Sertoli. spermatidi tardivi vengono poi rilasciati inlume tubulare e trasportati nelle epididimo di ulteriore maturazione. cellule di Sertoli e le cellule germinali sembrano coordinare reciprocamente spermatogenesi topograficamente e funzionale.
Preparazione dei singoli tipi di cellule testicolari iniziata quasi un secolo fa, quando piccoli pezzi testicolari sono state coltivate e tipi di cellule identificate al microscopio 2. Con un'attenta dissezione dei tubuli dopo l'apertura della tunica albuginea con pinze punta fine è stato poi possibile separare tubolare e compartimenti interstiziali 3. Nel 1975 Welsh e Wiebe introdotto un trattamento collagenasi per liberare i tubuli di aderire tessuto interstiziale e un trattamento pancreatina per la rimozione dello strato di cellule peritubulare esterna 4. Fin dall'inizio ratti giovani immaturi (circa 20 giorni) erano stati utilizzati in cui le cellule di Sertoli comprendono una grande frazione della popolazione delle cellule tubulari, perché la spermatogenesi non è ancora iniziato. A questo ratto Sert etàcellule oli cessano di dividersi, e giunzioni strette tra le cellule vicine formano in modo che la barriera emato-testicolare è stabilito 5.
Indipendente di Welsh e Wiebe Dorrington et al. Ha introdotto una combinazione di tripsina e deossiribonucleasi seguito da inibitore della tripsina e soybeen trattamento collagenasi che è stato pubblicato nello stesso anno 6. Entrambi i gruppi utilizzati anche forza meccanica (disegno frammenti digeriti tubolari volte attraverso un ago siringa o una pipetta Pasteur, rispettivamente) per produrre una sospensione omogenea per la placcatura che contiene circa il 70% di cellule di Sertoli. Dopo 3 giorni di coltura, utilizzando un mezzo che è privo di siero, la percentuale di cellule di Sertoli aumenta di circa il 90%. Questo potrebbe essere in gran parte attribuito alla morte di contaminare cellule germinali. Residui cellule peritubulari (CTP), tuttavia, rimanere saldamente attaccati tramite il loro matrice extracellulare. CTP, ma non le cellule di Sertoli, sono noti per la produzionefibronectina che può servire come una proteina marker per valutare la contaminazione con PTC. Pertanto, Tung et al. motivato che un trattamento ialuronidasi ulteriore potrebbe migliorare la purezza della frazione di cellule di Sertoli 7. In effetti si potrebbe dimostrano che un trattamento aggiuntivo è stato in grado di ridurre la contaminazione da PTC di circa 20 volte, che diventa particolarmente evidente quando in confronto un mezzo di siero contenente viene utilizzato per la coltivazione di cellule di Sertoli purificate. Da allora la procedura perfezionata di Tung et al. è diventato il protocollo prevalente ed è stato ampiamente utilizzato da altri gruppi importanti nel campo 8 (Figura 1B).
Durante il trattamento collagenasi la maggioranza dei PTC vengono rilasciati e può essere isolato in parallelo alle cellule di Sertoli. Considerando che le PTC vigorosamente proliferano e non rispondono al follicolo-stimolante (FSH), cellule di Sertoli non subiscono mitosi più e rispondere alle FSH da cambiamenti morfologici caratteristicie un aumento adenosina monofosfato ciclico (cAMP) concentrazione 9. Molto simili protocolli digestione enzimatica può essere utilizzato per l'isolamento delle cellule di Sertoli primarie da altri animali come l'uomo 10, il mouse 11,12, criceto siberiano 13 o 14 yak. Per la rimozione di grandi quantità di contaminanti cellule germinali uno shock ipotonico può essere impiegato al termine della procedura di isolamento 15. Ciò consente anche l'isolamento efficiente delle cellule di Sertoli da ratto adulto testicoli 16. Una sospensione di cellule di Sertoli arricchito può essere separato dalle cellule germinali dalla placcatura la sospensione su piatti lectina rivestiti con Datura stramonium agglutinine 17. Solo le cellule di Sertoli e un paio di PTC residui aderiscono alle piastre lectina.
colture cellulari primarie di Sertoli, soprattutto dal ratto, sono stati utilizzati inizialmente per studiare la reattività agli ormoni o la creazione di linee cellulari, come la Li cellule del mouse Sertoline TM4 18. Questa linea cellulare è stata valutata in più di un centinaio di studi fino ad oggi. In un approccio traslazionale cellule di Sertoli sono stati utilizzati per immuno-protezione delle cellule e dei tessuti, come nella co-trapianto di isole pancreatiche xeno- o allogenici per la sopravvivenza del trapianto a lungo termine co-coltura senza immunosoppressione sistemica 19. Cellule di Sertoli isolate sono stati utilizzati anche in esperimenti di co-coltura per lo studio epitelio-mesenchimale (cellule di Sertoli – PTCC) e di cellule somatiche di germi (cellule di Sertoli – cellule germinali) INTERAZIONI 20, 21. Cellule di Sertoli Recentemente primarie sono stati impiegati per studiare l'espressione dei recettori Toll-like e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, così come le cascate di trasduzione del segnale che porta a citochine espressione a seguito dell'infezione da non patogeni e uropatogeni E. coli 22. Altre indagini recenti stavano usando cellule del Sertoli per lo studio del testicolo p immunitariorivilege 23 e ha dimostrato che il testosterone pretrattamento sopprime la risposta infiammatoria LPS-indotta 24.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, che erano estremamente utile per stabilire l'isolamento delle cellule di Sertoli primarie in laboratorio Meinhardt a Giessen. Monika Fijak, Gießen, è riconosciuto per il suo aiuto con la figura 1A e consigli. Gli studi sono stati sostenuti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft attraverso concessione BH 93 / 1-1 (SB) e il finanziamento della ricerca internazionale laureato JLU Giessen (Germania) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Il sostegno è stato ottenuto anche da un contributo dello Stato di Hessen nell'ambito del programma "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) chiamato "männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. . Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
