Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes

Summary

Primær Sertolicellene er nødvendig for å studere testikkel-immun privilegium, signaltransduksjon under betennelse eller infeksjon, og utnyttelse av deres immunbeskyttende egenskaper. Her beskriver vi et enzymbasert protokoll for isolering av høy-rene primære Sertoli-celler og celler fra rotte peritubular testiklene.

Abstract

Testis, og i særdeleshet den mannlige kjønnsceller, utfordrer immunsystemet på en unik måte fordi differensiert sperm først vises ved pubertet – mer enn ti år etter etableringen av systemiske immuntoleranse. Spermatogenese celler uttrykker en rekke proteiner som kan bli sett på som er ikke-selv av immunsystemet. Testis må da være i stand til å etablere toleranse overfor disse neo-antigener på den ene side, men likevel være i stand til å beskytte seg mot infeksjoner og tumorutvikling på den annen side. Derfor testis er en av få immun privilegerte steder i kroppen som tåler fremmede antigener uten fremkaller en skadelig betennelsesimmunrespons. Sertoli-celler spiller en viktig rolle for opprettholdelse av denne immun privilegert miljø av testis og også forlenge overlevelse av cotransplanted celler i et fremmed miljø. Derfor primære Sertolicellene er et viktig verktøy for å studere immun privilegiet av testis som ikke kan være easily erstattet av etablerte cellelinjer eller andre cellemodeller. Her presenterer vi en detaljert og omfattende protokoll for isolering av Sertoli celler – og peritubular celler hvis ønskelig – fra rotte testes innenfor en enkelt dag.

Introduction

Testiklene produsere mannlige kjønnsceller og kjønnshormoner, dvs. androgener. Det organ er sammensatt av to avdelinger. I interstitiell rommet, som representerer ca 10-12% av total testikkelvolum ^1, steroidogenesis skjer innenfor Leydigcellene. Den rørformede rommet representerer om lag 60-80% av testikkelvolum ¹ og inneholder kjønnsceller og to typer somatiske celler – peritubular celler og Sertoli celler. Testis er delt av bindevev septa inn 250-300 lobules, som hver inneholder 1-3 svært convoluted sædkanaler. Disse rørelementene er omgitt av en basalmembran, et ark av kollagen, og en rundtgående lag av peritubular-celler (figur 1A).

Den germinal epitel er plassert på den luminale siden av basalmembranen. Sertoli-celler er store langstrakte celler som strekker seg over hele germinal epitel fra basalmembranen til lumen. De er sterkt attverket til basalmembranen og danner en kontinuerlig cellestruktur gjennom basolaterale organisert tett veikryss som tetter Germinal epitel fra interstitium og representerer blod-testikkelbarrieren. Sertolicellene har fremtredende cytoplasmatiske prognoser og konsekvenser som gjør dem i stand til å komme inn i tett morfologisk og funksjonell kontakt med en artsspesifikk, men konstant antall kjønnsceller. Diploide germinal stamceller spre og differensiere til spermatogonier.

Under meiose I kortvarig tetraploide spermatocytter genereres som utvikler videre inn i fire haploide spermatider under meiose II. Alle kjønnsceller er sammenkoblet ved cytoplasmatiske broer, slik at de danner en celledelt nett. Den hoved hendelse i løpet av modningen av spermatider er ekstrudering av store deler av cytoplasmaet, danner rest-legemer, i en prosess som kalles spermiogenesen. Resterende kropper er phagocytosed av Sertolicellene. Sene spermatider blir deretter sluppet utde rørformede lumen og transporteres inn i bitestikkelen for videre modning. Sertoli celler og kjønnsceller synes å gjensidig koordinere spermatogenesis topografisk og funksjonelt.

Utarbeidelse av individuelle testikkelcelletyper startet nesten et århundre siden, da små testikler stykker ble dyrket og celletyper identifisert ved mikroskopi ^to. Ved forsiktig disseksjon av tubuli etter åpning av tunica albuginea å bruke fin-tipped tang var det senere mulig å skille rørformet og interstitiell avdelinger ^3. I 1975 Welsh og Wiebe innført en kollagenase behandling for å frigjøre rørelementene fra å feste seg interstitielle vev og en pankreatin behandling for fjernelse av det ytre cellelaget peritubular ^4. Fra tidlig på unge umodne rotter (ca. 20 dager gamle) ble brukt i hvilken Sertoli-cellene utgjør en stor del av den rørformede cellepopulasjon fordi spermatogenesen ikke har begynt enda. I denne alderen rotte SertOLI cellene slutter å dele seg, og tett veikryss mellom naboceller dannes slik at blod-testikkelbarrieren er etablert ^fem.

Uavhengig av walisisk og Wiebe Dorrington et al. Innført en kombinasjon av trypsin og deoksyribonuklease fulgt av soybeen trypsin inhibitor og collagenase behandling som ble utgitt samme år ^6. Begge gruppene også brukes mekaniske kraft (tegning fordøyd rørformede fragmentene gjentatte ganger gjennom en sprøytenål ​​eller en Pasteur pipette henholdsvis) for å fremstille en homogen cellesuspensjon for plettering som inneholder omtrent 70% Sertoli-celler. Etter 3 dager i kultur, ved hjelp av et medium som er serumfritt, øker prosentandelen av Sertoli-celler til omtrent 90%. Dette kan i stor grad tilskrives døden av forurensende kjønnsceller. Rester peritubular celler (PTCs), men holde fast festet via sin ekstracellulære matrise. PTCs, men ikke Sertoli-celler, er kjent for å produserefibronektin som kan tjene som en markør protein for å estimere forurensning med PTCs. Derfor Tung et al. begrunnet at en ytterligere hyaluronidase behandling kan forbedre renheten av Sertoli-cellefraksjonen ^7. Faktisk kan de vise at en ytterligere behandling var i stand til å redusere forurensning av PTCs tilnærmet 20 ganger, noe som blir særlig tydelig når sammenlignet et serumholdig medium benyttes for dyrking av renset Sertoli-celler. Fra da av den forbedrede prosedyren for Tung et al. ble den rådende protokollen og er mye brukt av andre hovedgrupper i felt ⁸ (figur 1B).

Under kollagenase behandling flertallet av PTCs blir frigjort og kan isoleres i parallell med Sertoli-celler. Mens PTCs kraftig spre og ikke svare på follikkelstimulerende hormon (FSH), trenger Sertolicellene ikke gjennomgå mitose lenger og svare på FSH ved karakteristiske morfologiske endringerog en økning i (cAMP) konsentrasjon ⁹ cyklisk adenosinmonofosfat. Svært like enzymatiske fordøyelse protokoller kan anvendes for isolering av primære Sertoli-celler fra andre dyr, som menneske ^10, mus ^11,12, sibirsk hamster ¹³ eller ¹⁴ jak. For fjerning av store mengder forurensende bakterieceller en hypotonisk sjokk kan anvendes ved enden av isoleringsprosedyren ^15. Dette gir også en effektiv isolering av Sertoli celler fra voksne rotte testiklene ^16. En beriket Sertoli cellesuspensjon kan også skilles fra kjønnsceller ved plating suspensjonen på lektin retter belagt med Datura stramonium agglutinin ^17. Bare Sertoli celler og noen få rest PTCs følge de lektin platene.

Primær Sertoli cellekulturer, hovedsakelig fra rotte, har vært brukt i første omgang for å undersøke respons på hormoner eller etablere cellelinjer som muse Sertoli celle line TM4 ^18. Denne cellelinjen har blitt undersøkt i mer enn hundre studier til i dag. I en translasjonell tilnærming Sertolicellene har blitt utnyttet for immuno-beskyttelse av co-dyrkede celler og vev som i co-transplantasjon av xeno- eller allogene bukspyttkjerteløyer for langsiktig pode overlevelse uten systemisk immunsuppresjon ^19. Isolerte Sertoli celler er også brukt i co-kultur eksperimenter for å studere epiteliale-mesenchymale (Sertolicellene – PTCC) og somatisk-bakterie celle (Sertolicellene – kjønnsceller) interaksjoner ^{20, 21.} Nylig primære Sertoli-celler er blitt anvendt for å undersøke ekspresjon av Toll-lignende reseptorer og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, så vel som signaloverførings kaskader som fører til cytokinproduksjon uttrykket etter infeksjon med ikke-patogen og uropathogenic E. coli ^22. Andre nyere undersøkelser brukte Sertolicellene for å studere testikkelimmun privilege ²³ og vist at testosteron forbehandling undertrykker LPS-indusert betennelsesreaksjon ^24.

Protocol

1. dyreetikk Statement Eksperimentene beskrevet her ble utført i henhold til retningslinjene for Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som kommunen og bekrefter den tyske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr for eksperimentelle formål (Tillatelse nr.: GI 20/23 Antall A 31 / 2012). 2. Utarbeidelse av Media, enzym Solutions og Dyr Fremstille 1% jod alkoholen ved å oppløse 1 g jod i 100 ml etanol. Forbered 2x 500 ml Dulbecco's fosfatbufret saltvann (PBS) u…

Representative Results

Den beskrevne fremgangsmåte tillater isolering av ca 12 x 10 7 Sertolicellene fra 10 rotte testiklene. 3 x 10 6 celler blir sådd ut per brønn på en 6-brønns plate, slik at seks til syv 6-brønns plater er tilgjengelige for eksperimenter på dag 7. Trypsin-DNase I fordøyelse er den mest kritiske trinnet i løpet av Sertoli-celleisolasjon. Hvis spaltning på dette punktet er fremme for langt, forholdet mellom kimceller / Sertoli-celler blir uforholdsmessig økni…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.