Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

Summary

células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato.

Abstract

O testículo, e em particular o gameta masculino, desafia o sistema imunológico de uma forma única, porque o esperma diferenciado aparecem em primeiro lugar no momento da puberdade – mais de dez anos após o estabelecimento da tolerância imunológica sistêmica. células espermatogénicas expressar um certo número de proteínas que podem ser consideradas como não-auto pelo sistema imunológico. O testículo deve, então, ser capaz de estabelecer a tolerância a estes neo-antígenos, por um lado, mas ainda ser capaz de proteger-se de infecções e desenvolvimento do tumor, por outro lado. Portanto, o testículo é um dos poucos lugares privilegiados do sistema imunológico do corpo que toleram os antígenos estranhos sem evocar uma resposta imune inflamatória prejudicial. células de Sertoli desempenham um papel chave para a manutenção deste ambiente privilegiado imune dos testículos e também prolongar a sobrevivência de células cotransplanted em um ambiente externo. Portanto, células de Sertoli primárias são uma importante ferramenta para estudar o privilégio imunitário do testículo que não pode ser easily substituídos por linhas celulares estabelecidas ou outros modelos de celulares. Aqui apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para o isolamento de células de Sertoli – e células peritubulares se desejado – a partir de testículos de ratos em um único dia.

Introduction

Testículos produzem gametas masculinos e hormônios sexuais, ou seja, os andrógenos. O órgão é composto de dois compartimentos. No compartimento intersticial, que representa cerca de 10-12% do volume total de testículo ^1, a esteroidogénese tem lugar no interior das células de Leydig. O compartimento tubular representa cerca de 60-80% do volume de testículo ¹ e contém células germinais, de dois tipos de células somáticas – peritubulares células de Sertoli e as células. O testículo é dividido por septos de tecido conjuntivo em 250-300 lóbulos, cada um contendo 1-3 túbulos seminíferos altamente complicadas. Estes tubos são fechados por uma membrana basal, uma folha de colagénio, e uma camada periférica de células peritubulares (Figura 1A).

O epitélio germinal está localizada no lado luminal da membrana basal. células de Sertoli são grandes células alongadas que se estendem por todo o epitélio germinal da membrana basal para o lúmen. Eles são fortemente attdoía para a membrana basal e formar uma folha contínua celular através de junções apertadas organizados basolaterais que oclui o epitélio germinal do interstício e representa a barreira hemato-testicular. células de Sertoli têm projeções citoplasmáticas proeminentes e ramificações que lhes permitam entrar em contato morfológica e funcional apertado com um número específico da espécie, mas constante de células germinativas. células-tronco germinais diplóides proliferam e se diferenciam em espermatogônias.

Durante a meiose I curta duração espermatócitos tetraplóides são gerados que desenvolvem ainda mais em quatro espermátides haplóides durante a meiose II. Todas as células germinais são interligadas por pontes citoplasmáticas de modo que eles formam uma rede celular. O principal evento durante a maturação dos espermatídeos é a extrusão de grandes partes do citoplasma, formação de corpos residuais, num processo denominado spermiogenesis. organismos residuais são fagocitadas pelas células de Sertoli. spermatids tardias são, em seguida, liberado paraa luz tubular e transportado para o epidídimo para posterior maturação. células de Sertoli e células germinativas parecem coordenar mutuamente espermatogênese topograficamente e funcionalmente.

Preparação de tipos de células testiculares individuais começou quase um século atrás, quando pequenos pedaços testiculares foram cultivadas e tipos de células identificadas por microscopia ^2. Por dissecção cuidadosa dos túbulos após a abertura da túnica albugínea usando uma pinça de ponta fina foi mais tarde possível separar tubular e compartimentos intersticial ^3. Em 1975 e Welsh Wiebe introduzido um tratamento de colagenase, a fim de libertar os túbulos de tecido aderente intersticial e um tratamento de pancreatina para a remoção da camada de células peritubular exterior ^4. Desde cedo ratos jovens imaturos (cerca de 20 dias de idade) foram usadas no qual as células de Sertoli compreendem uma grande fracção da população celular tubular porque a espermatogénese ainda não começou. Neste Sert rato idadeoli células deixam de se dividir, e junções apertadas entre as células vizinhas formar de modo que a barreira hemato-testicular é estabelecida ^5.

Independente do galês e Wiebe Dorrington et al. Introduziram uma combinação de tripsina e desoxirribonuclease seguido por inibidor soybeen tripsina e tratamento colagenase, que foi publicado no mesmo ano ^6. Ambos os grupos também utilizada força mecânica (desenho os fragmentos digeridos tubulares repetidamente através de uma agulha de seringa ou uma pipeta de Pasteur, respectivamente), a fim de produzir uma suspensão de células homogéneas para revestimento que contém aproximadamente 70% de células de Sertoli. Após 3 dias em cultura, utilizando um meio que é isento de soro, a percentagem de células de Sertoli aumenta para aproximadamente 90%. Isto poderia ser atribuído principalmente à morte de contaminar células germinativas. peritubulares células residuais (PTCs), no entanto, manter-se firmemente ligado através de sua matriz extracelular. PTCs, mas não de células de Sertoli, são conhecidos para produzirfibronectina que pode servir como uma proteína marcadora para estimar a contaminação com PTCs. Portanto, Tung et al. fundamentado que um tratamento adicional hialuronidase pode melhorar a pureza da fracção de células de Sertoli ^7. Na verdade, eles poderiam mostrar que um tratamento adicional foi capaz de reduzir a contaminação por PTCs aproximadamente 20 vezes, o que se torna particularmente evidente quando em comparação com um meio contendo soro é utilizado para a cultura de células de Sertoli purificados. A partir de então o procedimento melhorado de Tung et al. tornou-se o protocolo vigente e foi amplamente utilizado por outros grupos importantes no campo ⁸ (Figura 1B).

Durante o tratamento com colagenase a maioria dos PTCs são libertados e podem ser isolados em paralelo para células de Sertoli. Considerando que os PTCs vigorosamente proliferar e não respondem à hormona folículo-estimulante (FSH), células de Sertoli não sofrem mitose mais e responder aos FSH por alterações morfológicas característicose um aumento da adenosina monofosfato cíclico (cAMP) ⁹ concentração. Protocolos de digestão enzimática muito semelhantes pode ser usado para o isolamento de células de Sertoli primárias a partir de outros animais como o homem ^{10, 11,12} rato, hamster Siberiano ¹³ ou ¹⁴ Yak. Para a remoção de grandes quantidades de contaminantes de células germinais um choque hipotónico pode ser empregada, no final do procedimento de isolamento ^15. Isto permite também o isolamento eficiente de células de Sertoli de testículos de rato adulto ^16. Uma suspensão de células de Sertoli enriquecido também pode ser separado a partir de células germinais por plaqueamento da suspensão em pratos revestidos com lectina de aglutinina de Datura stramonium ^17. Apenas as células de Sertoli e algumas PTCs residuais aderir às placas de lectina.

culturas de células de Sertoli primário, principalmente a partir do rato, foram utilizados inicialmente para investigar a capacidade de resposta aos hormônios ou o estabelecimento de linhas celulares como o li células de Sertoline TM4 ^18. Esta linha celular foi investigada em mais do que uma centena de estudos até hoje. Numa abordagem as células de Sertoli de translação têm sido utilizados para a imuno-protecção de células e tecidos, como no processo de co-transplante de ilhéus pancreáticos alogénicos ou xeno- para a sobrevivência do enxerto a longo prazo co-cultivados sem imunossupressão sistémica ^19. Células de Sertoli isolados foram também usados ​​em experimentos de co-cultura para o estudo epitelial-mesenquimal (células de Sertoli – PTCC) e de células somáticas de germes (células de Sertoli – células germinativas) interações ^{20, 21.} Células de Sertoli recentemente primários foram utilizados para investigar a expressão de receptores de tipo Toll e a secreção de citoquinas pró-inflamatórias, bem como as cascatas de transdução do sinal que conduz à expressão de citocinas após infecção com E. não patogénico e uropatogênica coli ^22. Outras investigações recentes estavam usando células de Sertoli para estudar testicular p imunológicorivilege ²³ e demonstraram que a testosterona pré-tratamento suprime a resposta inflamatória induzida por LPS ^24.

Protocol

Declaração 1. Ética animal Experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes do Regierungspräsidium Giessen, Alemanha, como a autoridade local e confirme com o Código alemão de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Experimentais (Permissão não:. GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Preparação de Meios, soluções enzima e Animais Prepare 1% de álcool de iodo através da dissolução de 1 g de iodo em 100 ml de etanol. …

Representative Results

O procedimento descrito permite o isolamento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de testículos de ratos 10. 3 X 10 6 células são plaqueadas por cavidade em uma placa de 6 poços de modo a que seis a sete placas de 6 poços estão disponíveis para as experiências no dia 7. A tripsina-digestão com DNase I é o passo mais importante durante o isolamento de células de Sertoli. Se a digestão, neste ponto está avançando muito longe, a proporção de…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.