En ny tilnærming som eliminerer Håndtering for Studerer Aggresjon og "Loser" Effect i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Under bananflue kamper, atferdsmønstre observert, kjempe dynamikk, og tilknyttet læring og hukommelse er påvirket av eksperimentelle betingelser. Protokollen presenteres her beskriver en roman prosedyre som helt eliminerer håndtering av fluer under forsøkene. Dette forbedrer kampen dynamikk og tillater dannelsen av sterke "taper" effekter.
Abstract
Aggressiv oppførsel i Drosophila melanogaster er sammensatt av de sekvensielle ekspresjon av stereotypisk adferd mønstre (for analyse se 1). Dette komplekset atferd påvirkes av genetiske, hormonelle og miljømessige faktorer. Som i mange organismer, påvirker forrige kampopplevelse kampstrategi av fluer og utfallet av senere konkurranser: å miste en kamp øker sannsynligheten for å tape senere konkurranser, avslører "taper" effekter som trolig involverer læring og hukommelse 2-4. Læring og hukommelse som følger uttrykk for komplekse sosiale atferd som aggresjon, er følsom for pre-test håndtering av dyr 5,6. Mange eksperimentelle prosedyrer brukes i forskjellige laboratorier for å studere aggresjon 7-9 imidlertid ikke rutinemessig brukt protokoll som utelukker håndtering av fluene er for tiden tilgjengelig. Her rapporterer vi en ny atferds apparat som eliminerer håndtering av fluer, ved hjelp instead sine medfødte negative geotactic svar å flytte dyrene inn i eller ut av kamp kamre. I denne protokollen, er små sirkulære kamparenaer som inneholder en mat cup delt i to like halvdeler av en flyttbar plastglidebryteren før innføring av fluer. Fluer skriv kamre fra sine hjem isolasjon ampuller via skyvekammerdører og geotaxis. Ved fjerning av glidere plast, fluer står fritt til å samhandle. Etter bestemte tidsperioder, er fluer igjen separert ved glidebrytere for påfølgende eksperimentering. Alt dette er gjort lett uten håndtering av individuelle fluer. Dette apparatet har en ny tilnærming for å studere aggresjon og tilhørende læring og hukommelse, inkludert dannelsen av "taper" effekter i flue kamper. I tillegg kan denne nye generell atferdsapparat brukes til å studere andre sosiale atferd av fluer og bør generelt være av interesse for å undersøke erfaringsmessige endringer i fundamentale atferdsprosesser.
Introduction
Aggresjon i dyre systemer er sterkt knyttet til oppkjøpet og beholdning av ressurser som mat, territorium og mates. Gitt den viktige rollen dette spiller i trenings av enkeltpersoner, er det ikke overraskende at aggresjon har utviklet seg over dyreriket. Som en adaptiv egenskap som direkte fordeler enkeltpersoner, er en sterk læring og hukommelse komponent forbundet med aggresjon. I konkurransen om sosial rang, påvirker forrige kampopplevelse utfallet av senere konkurranser. Generelt tidligere tapende erfaring øker, og vinne erfaring minsker sannsynligheten for å miste senere konkurranser (kalt "taper" og "Vinner" effekter). "Loser" effekter har blitt observert i et bredt spekter av arter, og noen rapporter tyder på at disse kan vare i flere dager mens "Vinner" effekter vanligvis er av kortere varighet 2,10,11.
Den første rapporten av aggressiv atferdi fruktfluer (D. ampelophila) var Sturtevant i 1915 i en opptatt av sex anerkjennelse og kjønnsseleksjon 12 papir. Et halvt århundre senere, mer komplette undersøkelser av mannlig bananflue aggresjon ble gjort, som beskrev de fleste av atferdsmønstre observert under fruktflue kamper. Disse eksperimentene ble for det meste utført i små grupper av mannlige og kvinnelige fluer observert i løpet av timer 13-15. Nylig, med tillegg av kraftige genetiske verktøy, dyadic enkelt sex kampoppsett og kortere perioder med observasjon, D. melanogaster har dukket opp som en viktig modellsystem for å studere biologi aggresjon 1,16. Analyse av kamper mellom samme kjønn par av mannlige og kvinnelige fluer vist at aggresjon innebærer stereotype atferdsmønstre som overgangen fra den ene til den andre i en statistisk pålitelig måte 1,17. Noen av de atferdsmønstre observert er kjønnsspesifikk mens andre er observert i kampens i begge kjønn. Mann kamper går til høyere intensitetsnivåer enn kvinnelige kamper og resultat i dannelsen av dominans relasjoner med klare "vinnere" og "tapere". I dag har mange laboratorier begynt å undersøke biokjemiske 18, nevrale 7,19-21, og genetiske 22 fundamentet for aggresjon. Dessverre, til en meta-analyse av studier få innsikt i kampen dynamikk og dannelse og vedlikehold av dominans relasjoner er problematisk på grunn av bruk av et mangfold av eksperimentelle prosedyrer i forskjellige laboratorier. Hovedsak alle de teknikkene som er beskrevet i litteraturen bære håndtering og manipulering av fluer å introdusere dem til arenaer 19,23,24 og i løpet av atferdseksperiment 3,4 overføre fluer ut av arenaer. Forsiktig aspirasjon er den vanligste måten å manipulere fluer 3,4,23-25, men kald eller CO 2 anestesi brukes også 9,26, selv om porrige studier allerede har rapportert at disse prosedyrene har skadelige effekter på fly atferd 27,28. En periode på minst 24 timer anbefales etter bruk av bedøvelsesmidler for å redusere sine effekter på atferd 29,30.
Fluer lære av tidligere kamperfaring og endre deres atferds bruksmønster i nye situasjoner, noe som tyder på at læring og hukommelse følge og er en konsekvens av agonistiske møter. I den forstand, fly kamper ligner til operant betinging læringssituasjoner der flyr lære at en strategi har fungert, og deretter bruke det mer og oftere under påfølgende møter. Fluer endre sine kampstrategier etter dominans relasjoner er etablert i løpet av kamper, med vinnere utagerer mer og mer og tapere mindre og mindre. Etter en periode med separasjon, tidligere tapere viser mye mer underdanig atferd og er svært sannsynlig å miste 2 nd kjemper da sammen med naive fltallet eller tidligere vinnere 3,4. Imidlertid har fraværet av en eksperimentell prosedyre som utelukker håndtering av fluer gjort detaljerte studier av "taper" effekter vanskelige. I en fersk undersøkelse, vi sammenlignet to eksperimentelle prosedyrer brukes rutinemessig i laboratorier (aspirasjon og kald-bedøvelse) å innføre fluer i atferds kamre til ny prosedyre som fjerner håndtering. Resultatene viste at kald-anestesi hadde langt større negative effekter på aggresjon enn håpet, men selv aspirasjon redusert nivå av aggressivitet av fluer. Aspirasjon gjorde imidlertid føre til svært betydelige effekter på læring og hukommelse som følger aggresjon. Etter identisk protokoll med to eksperimentelle prosedyrer (aspirasjon og ingen håndtering), en robust "taper" effekten ble bare observert ved håndteringen av fluer ble eliminert fra den eksperimentelle prosedyren 5,6.
Ideelt sett studier av Drosophila aggresjon i Laborier bør inneholde miljø situasjoner som flyr normalt møter i naturen (konkurranse om ressurser, territorium for å forsvare og plass til å flykte). I tillegg bør forsøksbetingelser bli optimalisert for å indusere en pålitelig måte, å observere og tolke oppførsel som undersøkes (forsøker å minimere dyr håndtering, begrense bruken av CO 2 som bedøvelse, og standardisere de eksperimentelle prosedyrer). I forsøket på å løse de fleste eller alle av disse problemene, har vi designet en ny atferds apparat som eliminerer håndtering av fluer før, under og etter introdusere dem til atferds arenaer. Med disse apparater, fluer bruke sine medfødte negative geotaxis å bli flyttet og overføres inn i og ut av kampen kamre. Ved å eliminere håndtering av fluer, har som mål protokollen til: (a) redusere atferds variasjonen mellom individer; (b) redusere tiden som er nødvendig for fluer å samhandle og generere klare dominans relasjoner (hanner); og (c) på en pålitelig måte å indusere sterk nok behavioRAL endringer for å tillate dannelsen av "taper" effekter.
Denne protokollen beskriver en ny eksperimentell apparatur og en trinnvis fremgangsmåte for å analysere aggresjon og for å tillate dannelsen av en sterk "taper" effekt i D. melanogaster. Vi forventer at dette atferds apparat kan enkelt tilpasses for studiet av andre sosiale atferd utvist av fruktfluer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den moderne æra av å bruke Drosophila med sin kraftige genetiske metoder som modellorganisme for studier av aggresjon begynte omtrent et dusin år siden med innføringen av nye eksperimentelle arenaer hvor pålitelig slåss atferd kan oppnås med enkle par fluer 1,7, 8,17,19. Disse arenaene inkludert ønskede ressurser (en mat cup, potensielle partnere) og en plass for loser flyr å trekke inn. Når resultatene oppnådd med disse arenaer ble tilsatt til tidligere kunnskap om fruktflue kjempe adferd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Institute of General Medical Sciences (GM099883 og GM074675) til EAK De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker folk fra vårt verksted ved Harvard Medical School for utformingen av atferds apparat (kontakt: http://mikesmachine.com).
Forfatter bidrag: ST, BC utviklet atferdsapparat. ST utviklet og optimalisert den eksperimentelle protokollen. ST og BC utført og analysert eksperimentene. ST, EAK og BC skrev avisen.
Materials
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and ‘loser’ effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ”loser” effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. 유전학. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning?. Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. . Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster?. PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
