Uma nova abordagem que elimina a manipulação de Estudos de Agressão e Efeito "perdedor" em<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Durante mosca de fruta lutas, os padrões comportamentais observados, luta dinâmica e aprendizagem e memória associada são influenciadas pelas condições experimentais. O protocolo aqui apresentado descreve um novo procedimento que elimina totalmente a manipulação de moscas durante as experiências. Isso melhora a dinâmica de luta e permite a formação de efeitos fortes "loser".
Abstract
Comportamento agressivo em Drosophila melanogaster é composto pela expressão sequencial de padrões comportamentais estereotipados (para análise de ver 1). Este comportamento complexo é influenciada por fatores genéticos, hormonais e ambientais. Como em muitos organismos, experiência de combate anterior influencia a estratégia de combate de moscas eo resultado dos concursos posteriores: perder uma luta aumenta a probabilidade de perder concursos posteriores, revelando efeitos "loser" que provavelmente envolvem a aprendizagem ea memória 2-4. A aprendizagem e memória que acompanha a expressão de comportamentos sociais complexos, como agressão, é sensível à manipulação dos animais 5,6-teste pré. Muitos procedimentos experimentais são utilizados em laboratórios diferentes para estudar a agressão 7-9, no entanto, não é utilizada rotineiramente protocolo que exclui manuseamento de moscas está actualmente disponível. Aqui, nós relatamos um novo aparelho de comportamento que elimina a manipulação de moscas, usando instead suas respostas negativas geotactic inatas para mover os animais para dentro ou para fora das câmaras de luta. Neste protocolo, pequenas arenas de luta circulares contendo uma xícara de alimentos são divididos em duas partes iguais por uma barra plástica removível antes da introdução de moscas. Moscas entrar nos aposentos de seus frascos de isolamento casa através de portas de correr de câmara e geotaxis. Após a remoção dos controles deslizantes de plástico, as moscas são livres para interagir. Após períodos de tempo específicos, as moscas são separados novamente por controles deslizantes para a experimentação subsequente. Tudo isso é feito facilmente, sem manipulação de moscas individuais. Este aparelho oferece uma nova abordagem para estudar a agressão ea aprendizagem e memória associada, incluindo a formação de efeitos de "loser" na mosca lutas. Além disso, este novo aparelho comportamental de uso geral pode ser empregada para estudar outros comportamentos sociais de moscas e deve, em geral, ser de interesse para a investigação de alterações relacionadas com a experiência em processos comportamentais fundamentais.
Introduction
Agressão em sistemas animais está fortemente associada com a aquisição e exploração de recursos como comida, território e companheiros. Dado o importante papel que este desempenha na aptidão dos indivíduos, não é de estranhar que a agressão evoluiu em todo o reino animal. Como um traço adaptativo que beneficia diretamente os indivíduos, uma componente de aprendizagem e memória forte está associada com a agressão. Na competição por posição social, combate experiência anterior influencia o resultado dos concursos posteriores. Em geral, experiência prévia de derrotas aumenta, e ganhando experiência diminui, a probabilidade de perder concursos posteriores (chamado de "perdedor" e efeitos "vencedor"). Efeitos "loser" foram observados em uma ampla gama de espécies, e alguns relatos sugerem que estes podem durar vários dias enquanto os efeitos "vencedor" costumam ser de menor duração 2,10,11.
O primeiro relato de comportamento agressivoem moscas da fruta (D. ampelophila) era por Sturtevant em 1915 em um artigo em causa com reconhecimento de sexo e seleção de sexo 12. Meio século depois, os exames mais completos de fruta masculina voar agressão foram feitas, que descreveu a maioria dos padrões comportamentais observados durante mosca de fruta lutas. Estes experimentos foram realizados na sua maioria em pequenos grupos de moscas macho e fêmea observadas ao longo 13-15 horas. Recentemente, com a adição de ferramentas genéticas poderosas, diádicas setups única luta sexo e tempos mais curtos de observação, D. melanogaster tem emergido como um sistema modelo para o estudo importante da biologia da agressão 1,16. Análise de brigas entre mesmos pares do sexo de moscas machos e fêmeas demonstrou que a agressão envolve padrões comportamentais estereotipados que a transição de um para o outro de uma forma estatisticamente confiáveis 1,17. Alguns dos padrões comportamentais observados são específicos de cada sexo, enquanto outros são observados em lutas em ambos os sexos. Lutas masculinas ir para níveis de intensidade mais elevadas do que as lutas femininas e resultar na formação de relações de dominância com claras "vencedores" e "perdedores". Actualmente, muitos laboratórios começaram a investigar a bioquímica 18, neural 7,19-21, e genéticos 22 bases de agressão. Infelizmente, uma meta-análise de estudos para obter insights sobre a dinâmica de luta e a formação e manutenção de relações de dominância é problemático devido ao uso de uma multiplicidade de procedimentos experimentais em laboratórios diferentes. Essencialmente, todas as técnicas descritas na literatura envolvem o manuseamento e manipulação de moscas para introduzi-los em arenas 19,23,24 e durante a experiência comportamental 3,4 para transferir as moscas fora de arenas. Aspiração suave é a forma mais comum de manipular moscas 3,4,23-25, mas frios ou de CO 2 anestesia também são usadas 9,26, apesar de previous estudos já relataram que esses procedimentos têm efeitos deletérios sobre o comportamento da mosca 27,28. Um período de pelo menos 24 horas depois é recomendado a utilização de anestésicos para minimizar os seus efeitos sobre o comportamento 29,30.
Moscas aprender com a experiência de luta anterior e modificar seu uso padrão de comportamento em situações novas, sugerindo que o aprendizado ea memória acompanhar e são conseqüências de encontros agonísticos. Nesse sentido, voar lutas se assemelham a situações de aprendizagem condicionamento operante em que voa aprender que uma estratégia funcionou e, em seguida, usá-lo mais e mais frequentemente durante os encontros subsequentes. Moscas mudar suas estratégias de combate depois de relações de dominância foram estabelecidas durante as lutas, com os vencedores se lançando mais e mais e perdedores cada vez menos. Depois de um período de separação, perdedores anteriores mostram um comportamento muito mais submissa e são altamente propensos a perder 2ª luta quando emparelhado com fl naïves ou vencedores anteriores 3,4. No entanto, a ausência de um procedimento experimental que exclui manipulação de moscas fez estudos detalhados de efeitos "loser" difíceis. Em um recente estudo, foram comparados dois procedimentos experimentais rotineiramente utilizados em laboratórios (aspiração e-anestesia frio) para introduzir moscas em câmaras de comportamento ao novo procedimento que elimina o manuseio. Os resultados mostraram que a anestesia-fria tinha muito maiores efeitos negativos sobre a agressão do que a aspiração, mas mesmo aspiração reduziu o nível de agressividade por moscas. Aspiração, no entanto, causar efeitos altamente significativos no aprendizado e na memória que acompanham agressão. Seguindo o protocolo idêntico com dois procedimentos experimentais (aspiração e nenhum tratamento), um robusto "vencido" efeito apenas foi observado quando o tratamento das moscas foi eliminado a partir do procedimento experimental 5,6.
Idealmente, os estudos de Drosophila agressão em labolabora- deve incluir situações ambientais que voa normalmente encontram em estado selvagem (competição por recursos, território para defender e espaço para escapar). Além disso, as condições experimentais devem ser optimizadas para induzir de forma confiável, observar e interpretar o comportamento em análise (tentar minimizar o manuseio animal, limitar o uso de CO 2 como anestésico, e padronizar os procedimentos experimentais). Na tentativa de resolver a maior parte ou todos estes problemas, foi elaborado um novo aparelho comportamental que elimina a manipulação de moscas antes, durante e depois introduzi-los em estádios comportamentais. Com estes aparelhos, moscas usar seus geotaxis negativos inatas para ser transferida e transferido para dentro e para fora das câmaras de luta. Ao eliminar a manipulação de moscas, o protocolo tem como objetivos: (a) reduzir a variabilidade comportamental entre os indivíduos; (b) diminuir o tempo necessário para as moscas para interagir e gerar relações de dominância claras (machos); e (c) induz de forma confiável o suficiente forte behavioral mudanças para permitir a formação de efeitos de "loser".
Este protocolo descreve um novo aparelho experimental e um procedimento passo a passo para analisar a agressão e permitem a formação de um "vencido" efeito forte em D. melanogaster. Espera-se que este aparelho de comportamento pode ser facilmente adaptado para o estudo de outros comportamentos sociais exibidos por moscas da fruta.
Protocol
Representative Results
Discussion
A era moderna da usando Drosophila com seus métodos genéticos poderosos como um organismo modelo para o estudo da agressão começou há cerca de uma dúzia de anos atrás, com a introdução de novas arenas experimentais em que o comportamento de combate de confiança poderia ser obtido com pares individuais de moscas 1,7, 8,17,19. Essas arenas incluídos recursos desejados (um copo de alimentos, companheiros potenciais) e um espaço para perdedor voa a recuar para. Quando os resultados obtidos co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM099883 e GM074675) para EAK Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos ao povo da nossa oficina mecânica na Harvard Medical School para a concepção do aparelho comportamental (contacto: http://mikesmachine.com).
Contribuições Autor: ST, BC projetou o aparelho comportamental. ST concebida e optimizada do protocolo experimental. ST e BC realizadas e analisadas as experiências. ST, EAK e BC escreveu o jornal.
Materials
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
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