Un nuevo enfoque que elimina el manejo para el estudio de la agresión y el efecto "Loser" en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Durante mosca de la fruta peleas, los patrones de comportamiento observados, lucha dinámica, y el aprendizaje y la memoria asociada están influenciadas por las condiciones experimentales. El protocolo que se presenta aquí describe un procedimiento novedoso que elimina por completo la manipulación de las moscas durante los experimentos. Esto mejora la dinámica de lucha y permite la formación de efectos fuertes "perdedor".
Abstract
El comportamiento agresivo en Drosophila melanogaster se compone de la expresión secuencial de patrones de conducta estereotipados (para el análisis ver 1). Este comportamiento complejo está influenciada por factores genéticos, hormonales y ambientales. Al igual que en muchos organismos, experiencia de lucha anterior influye en la estrategia de lucha de las moscas y el resultado de los concursos posteriores: perder una pelea aumenta la probabilidad de perder concursos posteriores, revelando efectos "perdedor" que probablemente impliquen el aprendizaje y la memoria 2-4. El aprendizaje y la memoria que acompaña a la expresión de complejos comportamientos sociales como la agresión, es sensible a la validez de la prueba de manejo de los animales 5,6. Muchos de los procedimientos experimentales se utilizan en diferentes laboratorios para estudiar la agresión 7-9, sin embargo, no rutinariamente protocolo utilizado que excluye la manipulación de las moscas está disponible actualmente. Aquí, se presenta un nuevo aparato de comportamiento que elimina el manejo de las moscas, utilizando INSTEAd sus innatas respuestas geotáctico negativos para mover los animales dentro o fuera de las cámaras de lucha. En este protocolo, pequeñas arenas de lucha circular que contiene una taza de alimentos se dividen en dos mitades iguales por una corredera de plástico extraíble antes de la introducción de las moscas. Las moscas entran en las cámaras de sus viales de aislamiento casa a través de puertas corredizas de cámara y geotaxis. Tras la eliminación de controles deslizantes de plástico, las moscas son libres de interactuar. Después de períodos de tiempo especificados, las moscas se separan de nuevo por controles deslizantes para la posterior experimentación. Todo esto se hace fácilmente sin manejo de moscas individuales. Este aparato ofrece un nuevo enfoque para estudiar la agresión y el aprendizaje y la memoria asociada, incluyendo la formación de efectos "perdedor" en peleas mosca. Además, este nuevo aparato de comportamiento de uso general se puede emplear para estudiar otras conductas sociales de moscas y debe, en general, ser de interés para la investigación de los cambios relacionados con la experiencia en los procesos de comportamiento fundamentales.
Introduction
Agresión en sistemas animales está fuertemente asociado con la adquisición y tenencia de los recursos como los alimentos, el territorio y compañeros. Dado el importante papel que desempeña en el estado físico de las personas, no es de extrañar que la agresión se ha desarrollado en todo el reino animal. Como un rasgo adaptativo que beneficia directamente a los individuos, un aprendizaje y la memoria fuerte componente se asocia con la agresión. En la competencia por el rango social, experiencia en la lucha anterior influye en el resultado de los concursos posteriores. En general, antes que aumenta la experiencia perdedoras, y la experiencia de ganar disminuye, la probabilidad de perder concursos posteriores (llamados "perdedor" y efectos "ganador"). Efectos "Loser" se han observado en una amplia gama de especies, y algunos informes sugieren que estos pueden durar varios días mientras que los efectos "ganador" suelen ser de menor duración 2,10,11.
El primer informe de la conducta agresivaen moscas de la fruta (D. ampelophila) fue por Sturtevant en 1915 en un documento de que se trate con el reconocimiento de sexo y la selección del sexo 12. Medio siglo más tarde, los exámenes más completos de la fruta macho agresión volar se hicieron, que describe la mayoría de los patrones de comportamiento observados durante los combates de la mosca de la fruta. Estos experimentos se llevaron a cabo en su mayoría en pequeños grupos de moscas machos y hembras observadas durante horas 13-15. Recientemente, con la incorporación de potentes herramientas genéticas, diádicas configuraciones individuales de lucha sexo y tiempos más cortos de observación, D. melanogaster se ha convertido en un importante sistema modelo para el estudio de la biología de la agresión 1,16. Análisis de peleas entre parejas sexuales de los mismos moscas macho y hembra demostró que la agresión implica patrones de conducta estereotipadas que la transición de uno a otro de una manera estadísticamente confiable 1,17. Algunos de los patrones de comportamiento observados son sexo-específicas, mientras que otros se observan en la luchas en ambos sexos. Peleas masculinas van a niveles de intensidad más altos que las peleas femeninas y dar lugar a la formación de relaciones de dominancia con "ganadores" y "perdedores claros". En la actualidad, muchos laboratorios han comenzado a investigar la bioquímica 18, neural 7,19-21, y genéticos 22 bases de agresión. Por desgracia, un meta-análisis de estudios para comprender mejor la dinámica de la lucha y de la formación y el mantenimiento de relaciones de dominancia es problemático debido a la utilización de una multiplicidad de procedimientos experimentales en diferentes laboratorios. Esencialmente todas las técnicas descritas en la literatura implican manejo y manipulación de las moscas para introducirlos en arenas 19,23,24 y durante el experimento de comportamiento 3,4 para transferir moscas de arenas. Aspiración suave es la forma más común de manipular moscas 3,4,23-25, pero frío o CO 2 anestesia también se utilizan 9,26, a pesar de que pestudios de la mera existencia ya han informado de que estos procedimientos tienen efectos nocivos sobre el comportamiento de la mosca 27,28. Se recomienda un periodo de al menos 24 horas después de la utilización de cualquier anestésicos para minimizar sus efectos sobre el comportamiento 29,30.
Moscas aprenden de la experiencia de lucha anterior y modificar su uso de patrón de comportamiento en situaciones nuevas, lo que sugiere que el aprendizaje y la memoria acompañan y son consecuencias de encuentros agonísticos. En ese sentido, vuelan peleas se asemejan a las situaciones de aprendizaje condicionamiento operante en el que vuela a aprender que la estrategia ha funcionado y luego use con más y más a menudo durante los encuentros posteriores. Las moscas cambian sus estrategias de lucha después de las relaciones de dominación se han establecido durante los combates, con los ganadores lanzarse más y más y perdedores cada vez menos. Después de un período de separación, perdedores anteriores muestran un comportamiento mucho más sumisa y son altamente propensos a perder 2º combate cuando se combina con fl ingenuoies o ganadores anteriores 3,4. Sin embargo, la ausencia de un procedimiento experimental que excluye el manejo de moscas ha hecho estudios detallados de efectos "perdedor" difíciles. En un reciente estudio, se compararon dos procedimientos experimentales utilizados rutinariamente en los laboratorios (aspiración y fría-anestesia) para introducir las moscas en las cámaras de comportamiento al nuevo procedimiento que elimina el manejo. Los resultados mostraron que en frío anestesia tenía mucho mayores efectos negativos sobre la agresión de aspiración, pero incluso la aspiración reduce el nivel de agresividad por las moscas. Aspiración hizo, sin embargo, causa efectos altamente significativos en el aprendizaje y la memoria que acompaña a la agresión. Siguiendo el protocolo idéntico a dos procedimientos experimentales (aspiración y no de manipulación), un efecto robusto "perdedor", sólo se observó cuando el manejo de moscas fue eliminado del procedimiento 5,6 experimental.
Idealmente, los estudios de Drosophila agresión en laboratorios deben incluir situaciones ambientales que las moscas normalmente encuentran en la naturaleza (competencia por los recursos, el territorio para defender y espacio para escapar). Además, las condiciones experimentales deben ser optimizados para inducir de manera fiable, observar e interpretar el comportamiento bajo examen (tratan de minimizar la manipulación de animales, limitar el uso de CO 2 como anestésico, y estandarizar los procedimientos experimentales). Al tratar de resolver la mayor parte o la totalidad de estos problemas, se diseñó un nuevo aparato de comportamiento que elimina el manejo de las moscas antes, durante y después de la introducción a escenarios de comportamiento. Con estos aparatos, las moscas utilizan sus geotaxis negativas innatas a ser trasladada y transferidos dentro y fuera de las cámaras de lucha. Mediante la eliminación de la manipulación de las moscas, el protocolo tiene como objetivos: (a) reducir la variabilidad de comportamiento entre los individuos; (b) reducir el tiempo necesario para las moscas que interactúan y generan relaciones de dominancia claras (machos); y (c) inducir fiable fuerte behavio suficientecambios rales para permitir la formación de los efectos de "perdedor".
Este protocolo describe un nuevo aparato experimental y un procedimiento paso a paso para analizar la agresión y para permitir la formación de un fuerte efecto "perdedor" en D. melanogaster. Esperamos que este aparato de comportamiento puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otros comportamientos sociales exhibidos por moscas de la fruta.
Protocol
Representative Results
Discussion
La era moderna de la utilización de Drosophila con sus métodos genéticos de gran alcance como un organismo modelo para el estudio de la agresión comenzó hace alrededor de una docena de años con la introducción de nuevos escenarios experimentales en los que la conducta de lucha confiable podría obtenerse con pares individuales de moscas 1,7, 8,17,19. Estos escenarios incluyen recursos deseados (una taza de comida, parejas potenciales) y un espacio para el perdedor vuela a retirarse a. Cuando s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM099883 y GM074675) para EAK Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a la gente de nuestro taller de mecánica en la Escuela de Medicina de Harvard para el diseño del aparato conductual (contacto: http://mikesmachine.com).
Contribuciones de los autores: ST, BC diseñaron el aparato de comportamiento. ST diseñado y optimizado el protocolo experimental. ST y BC realizado y analizado los experimentos. ST, EAK y BC escribió el documento.
Materials
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
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